[發明專利]一株廣譜抑制水產病原性弧菌的芽孢桿菌及其復合菌制劑

有效

• 申請號: 201810822881.3
• 申請日: 2018-07-25
• 公開（公告）號: CN108865953B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 田相利;蔣雯雯;王棟棟;李海東;趙坤;蔡玉勇;李超
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/22;A01P1/00;C12R1/125;C12R1/085
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1.一株廣譜抑制水產病原性弧菌的芽孢桿菌，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO.15949，保藏日期為2018年6月19日。

2.一種權利要求1所述的廣譜抑制水產病原性弧菌的芽孢桿菌在抑制弧菌中的應用。

3.一種權利要求1所述的廣譜抑制水產病原性弧菌的芽孢桿菌在水產養殖中的應用。

4.根據權利要求3所述的廣譜抑制水產病原性弧菌的芽孢桿菌在水產養殖中的應用，其特征在于，將所述枯草芽孢桿菌全池潑灑或拌料投喂。

5.根據權利要求3所述的廣譜抑制水產病原性弧菌的芽孢桿菌在水產養殖中的應用，其特征在于，將該芽孢桿菌兌水直接潑灑，其用量為10⁸cfu/m³；或拌料投喂，其用量為10¹¹cfu/kg。

6.一種以權利要求1所述的廣譜抑制水產病原性弧菌的芽孢桿菌為主要成分的復合菌制劑，其特征在于，所述復合菌制劑是由枯草芽孢桿菌BSXE-1601和蠟樣芽孢桿菌BCXE-01以5～8:1的細菌數比例復合而成。

7.一種權利要求6所述的復合菌制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)種子液培養

分別取分離、純化得到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BSXE-1601和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)BCXE-01的保種液于營養瓊脂和2216E固體培養基上進行劃線，并分別置于37℃和28℃條件下，活化24h；然后分別挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)BCXE-01單菌落接種于改良后的營養瓊脂培養基中，于28℃、190rpm條件下培養24h，得到兩種細菌的種子液；

所述營養瓊脂培養基的配方如下：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH為7.3，將配制好的培養基121℃，101KPa滅菌30min后使用；

所述2216E固體培養基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，瓊脂20g，陳海水1000mL，pH為7.6，將配制好的培養基121℃，101KPa滅菌30min后使用；

所述改良后的營養瓊脂培養基配方如下：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化鈉5g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸餾水1000ml，pH為7.3，將配制好的培養基121℃，101KPa滅菌30min后使用；

(2)擴大培養

兩種菌的種子液按枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601：蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)BCXE-01＝5～8:1的細菌數量比例進行混合后，控制此時混合種子液的細菌含量為1×10⁶～1×10⁷cfu/ml，按照混合種子液：改良后的營養瓊脂培養基的體積比為1:10的比例，將混合種子液接種到裝有改良后的營養瓊脂培養基的發酵罐中，于溫度為28℃，攪拌速度為190rpm，通氣量為4V/V.min，培養24h；

(3)復合菌劑的制備

按照混合種子液：液體發酵培養基的體積比為1:10的比例將混合種子液接種到裝有液體發酵培養基的發酵罐中，控制此時混合種子液的細菌含量為1×10⁶～1×10⁷cfu/ml，于溫度為28℃，攪拌速度為190rpm，通氣量為4V/V.min，培養48h后，濃縮得高濃度菌液；所述液體發酵培養基的配方如下：蛋白胨10g，玉米漿10g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸餾水1000ml，pH調至7.0，將配制好的培養基121℃，101KPa滅菌30min后使用；

將花生粕、玉米粉、硅藻土、膨潤土按照2:2:1:1的重量比例混合均勻并粉碎，制得輔料載體；將輔料載體和高濃度菌液按照1:2的重量比例混合均勻，再加入聚山梨酯和黃原膠，其中聚山梨酯的加入量為高濃度菌液質量的2-3％，黃原膠的加入量為高濃度菌液質量的1-3％；混合均勻，經烘干、粉碎、再混合均勻，即得復合菌制劑。