[發明專利]標準曲線法熒光定量PCR鑒定牛轉基因拷貝數的方法及引物

有效

• 申請號: 201810821611.0
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號: CN108676855B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 趙麗霞;王子馨;趙高平;李喜和
• 申請（專利權）人: 內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院有限公司;內蒙古賽科星繁育生物技術（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種標準曲線法熒光定量PCR鑒定牛轉基因拷貝數的引物，其特征在于，包括內參基因GAPDH熒光定量PCR反應使用的引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、待測基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc熒光定量PCR反應使用的引物對SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10，引物設計參數為引物長度18-25bp，Tm55-65℃，其中每對檢測引物的上游引物Tm值和下游引物Tm值相差不大于4℃，產物大小為100-300bp。

2.一種標準曲線法熒光定量PCR鑒定牛轉基因拷貝數的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取轉基因型——已轉牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛體細胞及野生型——未轉牛源4因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛體細胞的基因組DNA；

(2)提取已經構建完成的牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc轉基因質粒DNA；

(3)測定已轉牛源四因子牛體細胞及未轉牛源4因子牛體細胞樣品基因組DNA質量和濃度，統一稀釋成同一濃度50ng/ul；

(4)根據內參基因GAPDH DNA基因片段設計并合成引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；根據待測牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc轉基因質粒DNA基因片段設計并合成引物對SEQID NO.3～SEQ ID NO.10；

(5)標準曲線法熒光定量PCR；

(6)溶解曲線分析確定其唯一性：溶解曲線若為單峰，說明在熒光定量PCR擴增過程中沒有出現非特異性擴增，由此推斷熒光定量PCR擴增所獲得的數據是可靠的；

(7)分析熒光定量PCR數據，確定轉基因拷貝數N。

3.根據權利要求2所述標準曲線法熒光定量PCR鑒定牛轉基因拷貝數的方法，其特征在于，所述步驟(5)包括以下步驟：

(1)測定牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc轉基因質粒DNA質量和濃度，將提取的牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc轉基因質粒DNA統一10x稀釋5個梯度，分別為10⁰,10^-1,10^-2,10^-3,10^-4倍，分別以不同稀釋度的轉基因質粒DNA為標準品模板；

(2)用待測基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc引物SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10及內參基因GAPDH引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2對10⁰,10^-1,10^-2,10^-3,10^-4倍不同稀釋度的轉基因質粒DNA標準品模板進行熒光定量PCR反應，根據轉基因質粒DNA標準品熒光定量PCR反應實驗檢測結果繪制出△CT值對應的log₂^N(N代表拷貝數)的標準曲線，計算公式為：log₂^N＝A*△CT+B N代表拷貝數，△CT＝CT(待測基因)-CT(GAPDH)；

(3)用待測基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc引物SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10及內參基因GAPDH引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2對已轉牛源四因子牛體細胞及未轉牛源4因子牛體細胞樣品基因組DNA進行熒光定量PCR反應，根據熒光定量PCR反應實驗檢測結果得出△CT值，△CT(轉基因型)＝CT(轉基因型待測基因)-CT(轉基因型GAPDH)，△CT(野生型)＝CT(野生型待測基因)-CT(野生型GAPDH)。

4.根據權利要求2所述標準曲線法熒光定量PCR鑒定牛轉基因拷貝數的方法，其特征在于，所述步驟(7)包括以下步驟：

(1)根據已轉牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc轉基因牛體細胞△CT(轉基因型)值代入對應的標準曲線進行拷貝數分析；

(2)根據未轉牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛體細胞△CT(野生型)值代入對應的標準曲線進行拷貝數分析。