[發(fā)明專利]一種銅綠假單胞菌工程菌株的制備方法、菌株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810817807.2
• 申請日: 2018-07-24
• 公開（公告）號(hào): CN109097374A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 駱健美;王敏;李曉;夏夢雷;黃亦馨;閆仁杰
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/10;C12N15/78;C12N15/66;C12P17/12;H01M8/16;C12R1/385
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

1.一種同時(shí)提高多個(gè)吩嗪類化合物產(chǎn)量和產(chǎn)電活性的銅綠假單胞菌工程菌株的制備方法，其特征在于：利用連續(xù)易錯(cuò)PCR方法對來源于耐輻射異常球菌中的全局轉(zhuǎn)錄因子IrrE進(jìn)行突變，篩選得到的突變體導(dǎo)入銅綠假單胞菌PAO1中。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)提高多個(gè)吩嗪類化合物產(chǎn)量和產(chǎn)電活性的銅綠假單胞菌工程菌株的制備方法，其特征在于：連續(xù)易錯(cuò)PCR方法步驟如下：

(1)從耐輻射異常球菌R1菌體中提取總DNA，以耐輻射異常球菌R1基因組為模板，設(shè)計(jì)引物irrE-F和irrE-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證純度回收目的基因；

(2)通過改變PCR反應(yīng)條件中Mg²⁺濃度(3mM)和Mn²⁺濃度(0.1-0.4mM)的方法進(jìn)行易錯(cuò)PCR；

(3)挑取含有pMD18T質(zhì)粒的E.coli DH5α單菌落接入含有氨芐青霉素抗性的5mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃～37℃，160～200r/min振蕩培養(yǎng)12h，取1.5mL的培養(yǎng)液，10000r/min離心1min后收集菌體，進(jìn)行質(zhì)粒提取；

(4)利用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I對提取的pMD18T質(zhì)粒與回收得到的irrE易錯(cuò)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，按照載體與插入片段摩爾比例1：3，配制連接體系，使用T4連接酶，16℃連接過夜；

(5)將上述重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞并將轉(zhuǎn)化液涂布在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)約12h，挑取平板上長出來的單菌落接種于裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，液體培養(yǎng)基中含有100μg/mL氨芐青霉素，200r/min震蕩培養(yǎng)12h，收集菌體并重提質(zhì)粒，利用PCR和雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，將酶切得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段回收，并作為模板進(jìn)行第二輪和第三輪易錯(cuò)PCR；

(6)將第三輪易錯(cuò)PCR產(chǎn)物連接到pHERD20T質(zhì)粒上，并導(dǎo)入到銅綠假單胞菌PAO1感受態(tài)細(xì)胞中，LB固體平板上長出來的轉(zhuǎn)化子重提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。

3.一種IrrE定向改造的高產(chǎn)吩嗪類物質(zhì)和電活性突變體IrrE_M1-59，其特征在于：所述突變體IrrE_M1-59的基因序列SEQ ID NO:1所示。

4.一種IrrE定向改造的高產(chǎn)吩嗪類物質(zhì)和電活性突變體IrrE_M1-123，其特征在于：所述突變體IrrE_M1-123的基因序列SEQ ID NO:2所示。

5.一種IrrE定向改造的高產(chǎn)吩嗪類物質(zhì)和電活性突變體IrrE_M2-39，其特征在于：所述突變體IrrE_M2-39的基因序列SEQ ID NO:3所示。

6.一種IrrE定向改造的高產(chǎn)吩嗪類物質(zhì)和電活性突變體IrrE_M2-59，其特征在于：所述的突變體IrrE_M2-59的基因序列SEQ ID NO:4所示。