[發明專利]一種特異性檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的檢測試劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201810814584.4
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN108866087B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 張海濤;伍俊
• 申請（專利權）人: 廣東醫科大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/64;C12N15/85;C12Q1/37
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 劉瑤云;陳偉斌

本發明屬于基因工程技術領域，具體公開了一種特異性檢測(1?3)?β?D?葡聚糖的檢測試劑及其制備方法。本發明分別得到了鱟G因子酶原α亞基、β亞基和凝血酶原基因的核苷酸優化序列，如SEQ ID NO：1～3所示；還得到了共同表達上述3種關鍵因子的核苷酸序列，如SEQ ID NO：4所示；并成功構建了單獨表達或共同表達3種關鍵因子的真核表達載體，最后成功獲得了類似天然鱟試劑的人工鱟試劑，可用于檢測(1?3)?β?D?葡聚糖，而且靈敏度高，特異性強，可降低假陽性，制備工藝簡單，無需提取純化蛋白，生產成本低，同時大大減少對野生鱟資源的需求，具有廣闊的市場應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測和醫療技術領域，具體地，涉及一種特異性檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的檢測試劑及其制備方法。

背景技術

深部真菌感染發病率逐年上升，因缺少有效的早期診斷手段，其病死率居高不下。目前，檢測真菌感染的方法有血培養、組織活檢、PCR技術和免疫學方法。其中，血培養和組織活檢因培養方法耗時長和檢出陽性率低，不宜作早期診斷；PCR只能檢測已知致病真菌感染，不適合早期診斷罕見的條件致病真菌感染；而免疫學方法要做多種真菌抗原篩查，易漏診，且費時又不經濟。

鱟的血細胞溶解物可被微量的細菌內毒素或微量的真菌細胞壁成分(1-3)-β-D-葡聚糖激活產生一系列的酶促反應最終形成凝膠，該反應的機理如圖1所示。深部真菌感染的嚴重程度常與血漿(1-3)-beta-D-葡聚糖(即(1-3)-β-D-葡聚糖)的升高水平一致，而(1-3)-β-D-葡聚糖可特異性激活自鱟血細胞的G因子，此過程稱為G試驗。G試驗在深部真菌感染的早期診斷中具有較高敏感性和特異性，所以臨床檢驗已收錄G試驗作為真菌感染的早期診斷方法。

鱟試劑主要成分包括C因子、B因子、G因子、凝固酶原、凝固蛋白原(或顯色基質)、二價陽離子和緩沖鹽等。但是，因鱟凝血過程有兩條不同的激活途徑，一條是內毒素介導的C因子途徑：C因子(FC)結合內毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子將凝固酶原(Proclotting enzyme)轉化為凝固酶(clotting enzyme)，凝固酶將凝固蛋白原轉化為凝固蛋白，凝固蛋白相互交聯脫水而形成凝膠；另一條是由1,3-β-D-葡聚糖介導的G因子(FG)途徑，同樣可以引起相似的凝集反應，產生假陽性結果，因此，自然來源的鱟試劑不能直接用于檢測真菌感染。

目前，盡管有在鱟試劑中通過添加抗脂多糖物質來增加檢測特異性的方法，但其并不能完全阻斷內毒素對G試驗的干擾，容易產生假陽性結果。另外，鱟試劑只能通過收集鱟血淋巴生產，制備鱟試劑嚴重依賴鱟資源，隨著生物制品、醫藥如：注射用藥劑、化學藥品類、放射性藥物、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫療器械(如一次性注射器，植入性生物材料)等生產單位迅速增長，真菌感染檢測試劑的需求越來越大，使得海洋中鱟的數量逐漸減少。因此，開發不依靠使用鱟血淋巴的，用于診斷真菌感染的鱟血G因子變得越來越重要。

發明內容

本發明的目的是為了克服上述現有技術的缺陷，提供一種特異性檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的檢測試劑。該檢測試劑可作為天然鱟試劑的替代品，排除了C因子旁路干擾，從而有效地避免了內毒素產生假陽性的可能性，靈敏度高、特異性強，并且解決了鱟數量有限、鱟試劑各批次不穩定性的缺點，可作為新型(1-3)-β-D-葡聚糖檢測試劑，可通用于現有的各種采用(1-3)-β-D-葡聚糖檢測診斷技術檢測真菌感染的試劑盒。

本發明的第一個目的在于提供一種表達鱟G因子酶原α亞基和β亞基的重組基因。

本發明的第二個目的在于提供一種表達鱟凝血酶原的重組基因。

本發明的第三個目的在于提供一種共表達鱟G因子酶原α亞基、β亞基和凝血酶原的重組基因。

本發明的第四個目的在于提供一種含有上述任一所述的重組基因的真核表達載體。

本發明的第五個目的在于提供一種含有上述真核表達載體的宿主細胞。