[發(fā)明專利]一種綿羊羔羊瘤胃上皮細胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810811345.3
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN109097320A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉軍花;劉理想;毛勝勇;朱偉云;孫大明
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)獲取羔羊瘤胃后腹盲囊靠近后溝處組織，將瘤胃內(nèi)容物沖洗干凈；

(2)鈍性分離并清洗瘤胃組織；

(3)將瘤胃組織裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮組織呈現(xiàn)粘性且乳頭發(fā)白，進行清洗；

(4)清洗后用胰蛋白酶繼續(xù)消化，每隔一段時間收集一次細胞懸液，將細胞懸液過濾后混合，離心收集細胞；

(5)收集到的細胞沉淀清洗，完全培養(yǎng)基重懸細胞后，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；

(6)換瓶培養(yǎng)以去除成纖維細胞；定期更換培養(yǎng)基，完成鋪層，即培養(yǎng)所得的細胞為瘤胃上皮細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)所述瘤胃內(nèi)容物先用滅菌的D-Hanks溶液沖洗干凈，然后用含青鏈霉素的D-Hanks溶液各方向刷洗多次，直至溶液出現(xiàn)澄清為止。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)所述鈍性分離為用分離工具將黏附的漿膜層和肌肉層分離，再用含青鏈霉素的D-Hanks溶液沖洗。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)所述將瘤胃組織裁剪后，用含青鏈霉素的D-Hanks溶液清洗，然后平鋪在錐形瓶底部，再用添加三抗的胰蛋白酶和的乙二胺四乙酸消化。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三抗優(yōu)選為青霉素，鏈霉素和慶大霉素。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)所述瘤胃上皮組織呈現(xiàn)粘性且乳頭發(fā)白，消化時間短為2-3h；所述進行清洗為加含青鏈霉素的D-Hanks液清洗。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(5)所述每隔5～6分鐘收集一次細胞懸液，前2～3次的細胞懸液不收集，收集最后2～3次消化的細胞懸液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述最后2～3次消化的細胞懸液通過濾膜過濾后取上清液混合離心，離心條件轉(zhuǎn)速為1000～1500rpm，時間為8～10分鐘。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(5)所述收集到的細胞沉淀用D-Hanks溶液清洗，用完全培養(yǎng)基重懸細胞后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)均一，然后調(diào)節(jié)細胞密度至大于10⁶/ml，臺盼藍檢測細胞活率達到95％以上后接種到的培養(yǎng)瓶中。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述綿羊羔羊瘤胃上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(6)所述鋪層80％～90％左右時，用胰蛋白酶消化后可進行傳代或者液氮保存。