[發(fā)明專利]一種用于肝癌干細(xì)胞的鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810810259.0
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN108872603B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方蘇萍;邢繼亮;江志華
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州愛唯生命科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;C12P21/06
• 代理公司: 東營雙橋?qū)＠碛邢挢?zé)任公司 37107
• 代理人: 徐佳慧

1.一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：

1)取剔除了L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸以及甘氨酸的MEM培養(yǎng)基作為細(xì)胞培養(yǎng)基，在CO₂培養(yǎng)箱中，將待測細(xì)胞團(tuán)在所述細(xì)胞培養(yǎng)基中以28℃的溫度避光培養(yǎng)16h；

2)配制同時(shí)含有以下成分的水溶液作為誘導(dǎo)劑：HuEPO 25μg/L，聚氧乙烯月桂醚80μg/L，聚乙烯吡咯烷酮40μg/L，殼聚糖200μg/L，氯化鈉1mg/L，對羥基苯甲酸乙酯mg/L，BSA150μg/L，磷酸鹽緩沖液1mg/L；取步驟1)所得產(chǎn)物，收集細(xì)胞團(tuán)，接入所述誘導(dǎo)劑中，以35℃的溫度在厭氧、避光條件下保持24h；

3)取步驟2)所得產(chǎn)物，以15kHz的頻率超聲破碎8min，收集產(chǎn)物以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，收集液相，向其中加入4倍體積的、濃度為95％的乙醇，混合均勻后向其中加入氯仿-甲醇溶液于室溫下浸泡；收集沉淀物干燥，加入蛋白提取溶液提取；棄沉淀、取上清液即為總蛋白溶液；

4)向步驟3)得到的總蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇孵育，而后加入巰基封閉試劑，最后加入胰蛋白酶于33℃下孵育，將酶解后的蛋白脫鹽、干燥，即得到酶解產(chǎn)物；通過生物質(zhì)譜分析所述酶解產(chǎn)物中序列為NCIPDWPGAGPFAMGYAVLYGDPD的蛋白片段含量或序列為QNFYDKAALMGTPQKVYTQNDGLRAVVTN的蛋白片段含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于步驟1)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基在使用前用碳酸氫鈉或醋酸調(diào)整其pH為7.2，并用0.22μm孔徑的除菌濾膜過濾后再使用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于步驟1)中，在避光培養(yǎng)的過程中CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)CO₂濃度為8％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于步驟2)中所述的厭氧條件是通過氮?dú)獗Ｗo(hù)實(shí)現(xiàn)的；步驟2)在厭氧、避光保持的過程中對盛裝有細(xì)胞和誘導(dǎo)劑的容器持續(xù)震蕩。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于步驟2)所述的誘導(dǎo)劑中還包括80μg/L的乙二胺四乙酸二鈉和20μg/L的ZSTK474。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于所述氯仿-甲醇溶液中氯仿與甲醇的體積比為1:3；所述氯仿-甲醇溶液的加入量為濃度為95％乙醇的加入量的0.2～0.6倍。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于步驟3)中所述蛋白提取溶液是含有以下成分的水溶液：12.5％Tris-HCl、2％SDS、5％β-巰基乙醇、20％丙三醇、0.05％溴酚藍(lán)；其中所述Tris-HCl的pH值為6.8。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于步驟3)對沉淀物的干燥是在常溫條件下進(jìn)行真空干燥。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于步驟4)中胰蛋白酶的加入量為6000IU/g。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種用于肝癌干細(xì)胞的非診斷目的的鑒定方法，其特征在于在加入6000IU/g胰蛋白酶的同時(shí)，加入2500IU/g的木瓜蛋白酶，而后再進(jìn)行孵育。