[發(fā)明專利]一種方格星蟲β-肌動(dòng)蛋白基因及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810801904.2
• 申請(qǐng)日: 2018-07-19
• 公開（公告）號(hào): CN109055384A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李文華;馬國興;吳雅琴;徐嶸;許瑞安
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;姜謐

本發(fā)明公開了一種方格星蟲β?肌動(dòng)蛋白基因及其應(yīng)用，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 01所示。本發(fā)明從方格星蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到β?肌動(dòng)蛋白基因片段，結(jié)合同源克隆，得到方格星蟲β?肌動(dòng)蛋白的基因組DNA序列，根據(jù)cDNA序列和基因組DNA序列設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子熒光定量引物。本發(fā)明首次建立了在方格星蟲各個(gè)組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，可以快速、準(zhǔn)確、有效地用于方格星蟲基因表達(dá)研究。同時(shí)，采用此內(nèi)參做出的表達(dá)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果高度吻合，證明了采用β?肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參基因具有較好的穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種方格星蟲β-肌動(dòng)蛋白基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

方格星蟲(Sipunculus nudus)又名裸體方格星蟲或光裸星蟲，俗稱“沙蟲”，隸屬于星蟲動(dòng)物門，方格星蟲綱，方格星蟲科，方格星蟲屬^[1]。該種為暖水性世界廣泛分布的種類，我國沿海均有分布，是一種名貴的海產(chǎn)珍品。該種味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)及多種微量元素，具有重要的食用和藥用價(jià)值^[2]。目前，人們對(duì)方格星蟲的研究尚處于起步階段，已有研究多集中于活性成分提取、種質(zhì)資源、養(yǎng)殖和開發(fā)利用等方面，尚缺少分子生物學(xué)相關(guān)研究。開展方格星蟲分子生物學(xué)相關(guān)研究，從基因水平上理解方格星蟲活性成分的形成機(jī)制，研究方格星蟲相關(guān)功能基因的表達(dá)模式，有助于在分子水平上掌握其活性成分形成及功能基因表達(dá)的基本規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制，以期有效地促進(jìn)人們對(duì)方格星蟲資源的開發(fā)，這對(duì)于方格星蟲養(yǎng)殖實(shí)踐有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

目前，研究基因表達(dá)的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)有mRNA水平上的實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northern雜交和半定量RT-PCR技術(shù)以及蛋白質(zhì)水平上的Western雜交技術(shù)，這些技術(shù)都需要選擇合適的內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行校正，從而獲得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。內(nèi)參基因是指在不同實(shí)驗(yàn)條件處理下、在不同的組織及細(xì)胞中都能相對(duì)穩(wěn)定地表達(dá)的基因，真核生物常用的內(nèi)參基因有肌動(dòng)蛋白基因(actin)、微管蛋白(tubulin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及18S rRNA等^[3]。

β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，是actin基因家族的一員，廣泛存在于真核生物的非肌細(xì)胞中，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，參與了真核細(xì)胞的大部分生理過程，如細(xì)胞分裂、染色體運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)及胞質(zhì)流動(dòng)等。同時(shí)，β-肌動(dòng)蛋白作為較為廣泛的管家基因，具有mRNA表達(dá)量高、表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)^[4，5]，目前被廣泛應(yīng)用于多種生物如人、小鼠、斑馬魚及其他淡水魚類等物種基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。目前，人們?cè)诜礁裥窍x功能基因鑒定和基因表達(dá)方面的研究尚處于起步階段，且暫時(shí)沒有可用于熒光定量PCR的內(nèi)參基因報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種方格星蟲β-肌動(dòng)蛋白基因。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述方格星蟲β-肌動(dòng)蛋白基因的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種方格星蟲β-肌動(dòng)蛋白基因，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 01所示。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其基因組核苷酸序列如SEQ ID NO 02所示。

上述方格星蟲β-肌動(dòng)蛋白基因作為方格星蟲定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參基因的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，擴(kuò)增所述方格星蟲β-肌動(dòng)蛋白基因的上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示。

一種方格星蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)方格星蟲mRNA的提取；

(2)將上述方格星蟲mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；