[發(fā)明專利]一種同時定量血漿內(nèi)、外源性葡萄糖的二維核磁共振方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810800114.2
• 申請日: 2018-07-20
• 公開（公告）號: CN108982569A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡凱鋒;黃滔;余玲玲;馬曉方
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院昆明植物研究所
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53108
• 代理人: 旃習(xí)涵

本發(fā)明提供一種同時定量血漿內(nèi)、外源性葡萄糖的二維核磁共振方法，利用少量D?[U?¹³C]葡萄糖作為示蹤物和內(nèi)標(biāo)的同位素稀釋法，結(jié)合適應(yīng)性改編的核磁單量子相關(guān)實(shí)驗(yàn)(ID?HSQC)，測定相應(yīng)的雙峰和單峰的積分比值，以此計(jì)算血漿中內(nèi)、外源性葡萄糖濃度。本發(fā)明具有樣品制備簡單(不需要除蛋白及衍生化等前處理步驟)、同位素標(biāo)記示蹤物用量少，能同時準(zhǔn)確測定血漿中內(nèi)、外源中葡萄糖濃度等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)方法領(lǐng)域，具體涉及一種基于穩(wěn)定性同位素稀釋法(isotopedilution,ID)結(jié)合二維核磁共振技術(shù)用于快速、準(zhǔn)確測定血漿中內(nèi)、外源性葡萄糖濃度的定量方法。更具體地說，涉及一種以D-[U-¹³C]-葡萄糖作為標(biāo)記物(示蹤物)，改編單量子相關(guān)核磁實(shí)驗(yàn)(HSQC)以測定血漿中內(nèi)、外源性葡萄糖濃度的方法(ID-HSQC)。

背景技術(shù)

葡萄糖是人及動物的重要能源物質(zhì)，在能量代謝中扮演著重要角色。血糖的監(jiān)測對多種疾病的診斷和治療具有重要意義，通常血糖濃度的測定是利用酶反應(yīng)的方法在自動分析儀上測試完成的。然而該方法并不能區(qū)分血樣中內(nèi)、外源性葡萄糖，而內(nèi)、外源性葡萄糖的含量測定是在臨床上研究葡萄糖代謝，胰島素敏感性等實(shí)驗(yàn)中的重要參數(shù)。目前用于這些臨床實(shí)驗(yàn)的方法主要方法有：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(GC-MS)、氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜聯(lián)用方法(GC-IRMS)、液相色譜-同位素比值質(zhì)譜聯(lián)用方法(LC-IRMS)以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法(LC-MS/MS)。但這些方法大多需要除蛋白，衍生化等繁瑣的前處理步驟，以及需要相對較大量的同位素示蹤物等缺點(diǎn)。因此開發(fā)樣品前處理簡單、同位素標(biāo)記物用量較少又能準(zhǔn)確測定血樣中內(nèi)、外源性葡萄糖的定量方法將具有重要實(shí)際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于穩(wěn)定性同位素稀釋法(isotope dilution,ID)結(jié)合二維核磁共振技術(shù)用于快速、準(zhǔn)確測定血漿中內(nèi)、外源性葡萄糖濃度的定量方法。更具體地說，涉及一種以D-[U-¹³C]-葡萄糖作為標(biāo)記物(示蹤物)，改編單量子相關(guān)核磁實(shí)驗(yàn)(HSQC)以測定血漿中內(nèi)、外源性葡萄糖濃度的方法(ID-HSQC)。本發(fā)明利用較低濃度的D-[U-¹³C]-葡萄糖(～0.035mM)作為標(biāo)記物的同位素稀釋法(Isotope Dilution)，結(jié)合改編的單量子相關(guān)核磁實(shí)驗(yàn)(HSQC)，簡單、準(zhǔn)確、快速地同時測定血漿中內(nèi)、外源性葡萄糖濃度。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種同時定量血漿內(nèi)、外源性葡萄糖的二維核磁共振方法，利用少量D-[U-¹³C]葡萄糖作為示蹤物和內(nèi)標(biāo)的同位素稀釋法，結(jié)合適應(yīng)性改編的核磁單量子相關(guān)實(shí)驗(yàn)(ID-HSQC)，測定相應(yīng)的雙峰和單峰的積分比值，以此計(jì)算血漿中內(nèi)、外源性葡萄糖濃度。

一種同時定量血漿內(nèi)、外源性葡萄糖的二維核磁共振方法，該方法包括下述步驟：

樣品制備：取適量的血漿，加入少量氘代試劑，混勻后轉(zhuǎn)移到核磁管；

核磁實(shí)驗(yàn)：在常規(guī)靈敏度增強(qiáng)單量子相關(guān)實(shí)驗(yàn)的脈沖序列基礎(chǔ)上，將碳通道的180度非選擇性重聚脈沖改為葡萄糖1號位¹³C¹化學(xué)位移選擇性重聚脈沖，從而消除δ1，δ2及隨后2τ時間內(nèi)碳碳耦合的演化，即消除了碳碳耦合對譜圖相位的影響；在脈沖序列的開始階段加入90-G_Z單元消除碳-13縱向磁化矢量；利用改編的脈沖序列采集二維HSQC實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)經(jīng)正弦平方窗函數(shù)變跡、零填充、傅立葉變換、相位校正得圖譜，積分獲取對應(yīng)信號的積分值；

濃度計(jì)算：利用核磁實(shí)驗(yàn)獲得的積分值，通過下面的公式計(jì)算出內(nèi)、外源葡萄糖摩爾濃度比值，