[發(fā)明專利]一種樹突狀表皮T淋巴細胞的分離培養(yǎng)方法

在審

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• 申請日: 2018-07-19
• 公開（公告）號: CN108949668A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 劉美希;羅高興;賀偉峰;燕榮帥;楊加彩;胡曉紅;龔雅利;羅小強;張成
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 重慶鼎慧峰合知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 50236
• 代理人: 周維鋒

本發(fā)明屬于細胞治療領域，具體涉及一種樹突狀表皮T淋巴細胞的分離培養(yǎng)方法，具體包括如下步驟：獲取小鼠軀干皮膚；提取樹突狀T淋巴細胞；擴增樹突狀T淋巴細胞。采用本發(fā)明的技術方法可以獲得高純度的樹突狀T淋巴細胞，將細胞培養(yǎng)4周，純度可達98％以上，遠遠大于原代培養(yǎng)技術，為后期康復性困難病人的治療奠定了堅實基礎。

技術領域

本發(fā)明屬于細胞治療領域，具體涉及一種樹突狀表皮T淋巴細胞的分離培養(yǎng)方法。

背景技術

樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟樹突狀細胞具有較強的遷移能力，成熟樹突狀細胞能有效激活初始型T細胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)，樹突狀細胞是迄今為止已知的體內(nèi)功能最為強大的專職抗原呈細胞，其表面存在豐富的抗原捕獲分子，抗原遞呈分子，免疫共刺激分子。

樹突狀細胞是一種異質(zhì)性細胞群，由于樹突狀細胞的特異性，它在激活免疫應答和誘導免疫耐受中都具有很重要的作用。樹突狀細胞廣泛存在于肝、脾、血液、淋巴及皮膚等組織器官，是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)中的抗原呈遞細胞，參與對抗原的捕捉、加工、處理以及呈遞等環(huán)節(jié)，是機體產(chǎn)生免疫應答的重要功能細胞之一，其可激活針對各種病原體的特異性T淋巴細胞反應，從而增強誘導產(chǎn)生T細胞介導的細胞毒作用，提高機體的細胞免疫水平，特別是可顯著提高自身抗原或其他弱抗原誘導的特異性反應，在抗感染、抗腫瘤、自身免疫疾病及移植排斥中發(fā)揮重要作用。

人樹突狀細胞起源于造血干細胞(hemopoieticstemcell)。樹突狀細胞的來源有兩條途徑：髓樣干細胞在GM-CSF的刺激下分化為樹突狀細胞，稱為髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cells，MDC)，也稱DCl，與單核細胞和粒細胞有共同的前體細胞；包括朗格漢斯細胞(Langerhans cells，LCs)，間皮(或真皮)樹突狀細胞以及單核細胞衍生的樹突狀細胞等來源于淋巴樣干細胞，稱為淋巴樣樹突狀細胞(Lymophiod dendritic cells，LDC)或漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，piX)，即DC2，與T細胞和NK細胞有共同的前體細胞。樹突狀細胞盡管數(shù)量不足外周血單核細胞的1％，但表面具有豐富的抗原遞呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，是功能強大的專職抗原遞呈細胞(APC)。樹突狀細胞自身具有免疫刺激能力，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一能激活未致敏的初始型T細胞的專職抗原遞呈細胞。

表皮組織是皮膚的最外層，構成了機體抵御外界病原入侵的第1道屏障，并且是機體發(fā)生快速免疫應答的重要防線。而樹突狀表皮內(nèi)T淋巴細胞(DETCs)是構成表皮組織免疫微環(huán)境的重要組成部分。T細胞按照T細胞受體(TCR)的不同可分為αβT細胞和γδT細胞。而DETCs主要表達γδTCR，故也被稱為表皮內(nèi)γδT細胞。研究表明小鼠DETCs的γδTCR主要是

Vγ3/Jγc1-Cγ1鏈和Vδ1/Dδ2/Jδ2-Cδ鏈構成。隨著γδT細胞在腫瘤、創(chuàng)面愈合中的作用被廣泛認同，它們在其它免疫過程中的重要作用也被越來越多的研究者關注，因此在體外對DETCs進行擴增培養(yǎng)在進行相關研究就變得尤為重要。目前的DETCs體外培養(yǎng)面臨諸多困難，首先，DETCs提取困難，皮膚上皮組織由大量的角質(zhì)形成細胞，γδT細胞，骨髓來源細胞，黑色素細胞等組成，DETCs在正常表皮中的比例只占5﹪～9％，而DETCs體外研究以及用于臨床治療對其純度要求很高，其次，應用目前的培養(yǎng)技術來做體外培養(yǎng)的DETCs很難長期存活。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種樹突狀表皮T淋巴細胞的分離培養(yǎng)方法，使用本技術方法分離培養(yǎng)的高純度的樹突狀表皮內(nèi)T淋巴細胞純度更高并且可以在體外進行長期培養(yǎng)，從而滿足對于樹突狀表皮內(nèi)T淋巴細胞質(zhì)量與數(shù)量的要求。