[發(fā)明專利]一種利用負壓滲透在花粉管加載熒光染料的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810798857.0
• 申請日: 2018-07-19
• 公開（公告）號: CN108827741A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發(fā)明（設計）人: 屈海泳;李坤;馬春暉;高超;王永章
• 申請（專利權）人: 青島農業(yè)大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N21/64
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 黃啟法

1.一種利用負壓滲透在花粉管加載熒光染料的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：原料預處理

在豐水梨花期，采集鈴鐺狀的花朵，取下成熟花藥，待花藥開裂后收集花粉，于-20℃條件下密閉保存；

步驟2：制備Fluo 4-AM母液

將50μg的Fluo 4-AM溶解在91.2μL的無水二甲基亞砜中，于-20℃條件下避光密封保存，得到Fluo 4-AM母液；

步驟3：制備花粉懸浮液

將步驟1中的-20℃條件下密閉保存的花粉于常溫放置1-2h后，與培養(yǎng)液混勻至最終濃度為1×10⁵-1×10⁷個花粉/mL，于25℃條件下培養(yǎng)0.5-2h，得到花粉懸浮液；

步驟4：制備Fluo 4-AM工作液

分別取1-5μL步驟2得到的Fluo 4-AM母液和10-100μL步驟3得到的花粉懸浮液，混勻后，得到Fluo 4-AM工作液；

步驟5：制備加載熒光染料的花粉管

將步驟4得到的Fluo 4-AM工作液，于負壓、低溫條件下避光培養(yǎng)0.5-2h，再離心，棄去上清，用培養(yǎng)液洗滌2-3次，即得到加載熒光染料的花粉管。

2.根據權利要求1所述的一種利用負壓滲透在花粉管加載熒光染料的方法，其特征在于，步驟3和步驟5中，所述培養(yǎng)液均是將溶質溶解在30mM的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物溶液中，其中，所述溶質為蔗糖、聚乙二醇、硼酸和硝酸鈣的混合物；在所述培養(yǎng)液中，蔗糖的質量百分比為10％，聚乙二醇的質量百分比為20％，硼酸的質量百分比為0.01％，硝酸鈣的質量百分比為0.03％。

3.根據權利要求1所述的一種利用負壓滲透在花粉管加載熒光染料的方法，其特征在于，步驟5中，所述負壓的壓力為-50kPa至-100kPa，低溫為0-4℃，所述離心的轉速12000rpm，時間為1min。