[發(fā)明專利]普通核不育突變體的創(chuàng)制方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810794443.0
• 申請(qǐng)日: 2018-07-18
• 公開（公告）號(hào): CN108949778A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉佳音;米鐵柱;張國(guó)棟;鄒丹丹;李繼明;丁錦燕;劉鵬飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島袁策集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京華仁聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11588
• 代理人: 李冰

本申請(qǐng)公開了一種普通核不育突變體的創(chuàng)制方法，包括以下步驟：T1.利用基因敲除技術(shù)，構(gòu)建基因敲除載體；T2.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將載體介導(dǎo)入胚性細(xì)胞中，從而獲得育性基因被沉默的細(xì)胞。所述T1.利用基因敲除技術(shù)，構(gòu)建基因敲除載體中，sgRNA序列設(shè)計(jì)如下：5’?ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC?3’5’?AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG?3’。本發(fā)明方法，以水稻細(xì)胞核育性基因作為目標(biāo)基因，利用CRISPR/cas9基因沉默進(jìn)行基因敲除，基因沉默后喪失功能，細(xì)胞發(fā)育長(zhǎng)成完整植株，但不具備發(fā)育成正常功能的花粉，并能夠以此為研究對(duì)象，用于創(chuàng)制不育系。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物植物不育突變體創(chuàng)制技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種普通核不育突變體的創(chuàng)制方法。

背景技術(shù)

雄性不育性是與作物雜種優(yōu)勢(shì)利用密切相關(guān)的重要性狀。水稻是利用雜種優(yōu)勢(shì)最為成功的作物之一，也是迄今發(fā)現(xiàn)雄性不育多樣性最為豐富的作物之一。雄性不育系成為雜種優(yōu)勢(shì)利用的最有效武器，其中三系”法是我國(guó)推廣雜交水稻最早，也是最普遍的一種育種和制種方法，“三系法”主要是利用了核質(zhì)互作雄性不育系統(tǒng)，完成了“恢復(fù)系”、“保持系”和“繁殖系”的三系配套。

其中的不育是由細(xì)胞質(zhì)的遺傳物質(zhì)和細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)共同決定。而光溫敏雄性不育系材料為基礎(chǔ)的“兩系法”，雖然它打破了恢保關(guān)系的限制，極大的提高了配組自由度，繁殖和配組程序也極大的簡(jiǎn)化，但育性的轉(zhuǎn)換收環(huán)境溫度和光照的影響，制種風(fēng)險(xiǎn)較大，這也是兩系雜交育種無(wú)法大面積推廣的原因。

自1966年袁隆平先生報(bào)道隱性核不育水稻后，相繼發(fā)現(xiàn)了許多不育材料。這類不育材料的共同特點(diǎn)是不育性穩(wěn)定、雜交制種安全，易于配制高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗組合；共同的缺點(diǎn)是無(wú)法實(shí)現(xiàn)不育系種子的批量繁殖。針對(duì)這一問題，科學(xué)家們一直在研究利用分子設(shè)計(jì)方法，解決不育系繁殖的難題，也先后提出了一些解決方案。

針對(duì)解決隱性核雄性不育材料的繁殖問題，1993年6月11日，PLANT GENETICSYSTEM公司(Albertsen)提出了一項(xiàng)PCT專利申請(qǐng)，該專利提出了一種技術(shù)思想：在純合的雄性不育植株中轉(zhuǎn)入連鎖的育性恢復(fù)基因、花粉失活(敗育)基因以及用于篩選的標(biāo)記基因，可以獲得該雄性不育植株的保持系，保持系通過自交就可以實(shí)現(xiàn)不育系和保持系的繁殖。

2002年，Perez-Prat等人提出，除了利用上述三套元件的思想可以實(shí)現(xiàn)不育系創(chuàng)制和繁殖以外，還可以通過在純合的雄性不育植株中轉(zhuǎn)入連鎖的育性恢復(fù)基因和用于篩選的標(biāo)記基因兩套元件，由此也可以獲得該雄性不育植株的保持系，并進(jìn)一步繁殖不育系(Perez-Prat，2002)。

這些報(bào)道提出了利用分子生物學(xué)技術(shù)手段，解決隱性核雄性不育基因及不育材料的繁殖問題，為開展分子設(shè)計(jì)雜交育種提供了新的思想。

以上分子設(shè)計(jì)育種的新思想基于的是水稻細(xì)胞核上一對(duì)控制育性的基因。當(dāng)此基因發(fā)生突變后，成為無(wú)功能的基因后，水稻花粉發(fā)育形成的過程受阻，從而產(chǎn)生無(wú)活性或不產(chǎn)生花粉，最終表現(xiàn)為不育。因此，突變體的獲取是后續(xù)基因改造的基礎(chǔ)，如何獲取育性基因突變的突變體成為制約此項(xiàng)工作的關(guān)鍵點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供了一種普通核不育突變體的創(chuàng)制方法，以水稻細(xì)胞核育性基因作為目標(biāo)基因，利用CRISPR/cas9基因沉默進(jìn)行基因敲除，基因沉默后喪失功能，細(xì)胞發(fā)育長(zhǎng)成完整植株，但不具備發(fā)育成正常功能的花粉，并能夠以此為研究對(duì)象，用于創(chuàng)制不育系。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種普通核不育突變體的創(chuàng)制方法，包括以下步驟：

T1.利用基因敲除技術(shù)，構(gòu)建基因敲除載體；

T2.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將載體介導(dǎo)入胚性細(xì)胞中，從而獲得育性基因被沉默的細(xì)胞。

所述普通核不育突變體的創(chuàng)制方法，進(jìn)一步包括：

T3.基因敲除檢測(cè)。