[發(fā)明專利]脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810794317.5 | 申請日： | 2018-07-19 |
| 公開（公告）號： | CN108866039A | 公開（公告）日： | 2018-11-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 章幼玉;汪斌;毛錚;陸楠;鐘淵福;柳清伙 | 申請（專利權(quán)）人： | 廈門大學 |
| 主分類號： | C12N13/00 | 分類號： | C12N13/00;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 廈門南強之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200 | 代理人： | 馬應(yīng)森 |
| 地址： | 361005 *** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 碳納米管 細胞懸浮液 脈沖電場 脈沖處理 電極杯 分散液 癌細胞 凋亡 離子 聯(lián)合 應(yīng)用 電脈沖處理 空白對照組 流式細胞儀 細胞存活率 實驗檢測 細胞凋亡 細胞生長 增殖能力 正負極板 納米管 實驗組 純電 純碳 制備 配制 克隆 施加 分析 | ||
1.脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，所述方法不涉及疾病的治療，其特征在于包括以下步驟：
1)制備細胞懸浮液；
2)配制三種碳納米管的不同濃度去離子分散液，所述三種碳納米管分別為：單臂碳納米管、雙臂碳納米管和多臂碳納米管；
3)將碳納米管去離子分散液與細胞懸浮液均勻混合，得到碳納米管-細胞懸浮液；
4)取細胞懸浮液加入電極杯中設(shè)置空白對照組和純電脈沖處理組；
5)取碳納米管-細胞懸浮液加入電極杯中設(shè)置純碳納米管處理組和脈沖電場聯(lián)合碳納米管處理組；
6)在電脈沖處理的實驗組的電極杯正負極板施加脈沖電場；
7)脈沖處理后，利用MTT法測定各處理組細胞存活率；
8)脈沖處理后，利用Annexin V-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀分析各處理組細胞凋亡情況；
9)脈沖處理后，利用克隆形成實驗檢測細胞生長增殖能力的變化。
2.如權(quán)利要求1所述脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，其特征在于在步驟1)中，所述細胞為人結(jié)腸癌細胞系HCT116。
3.如權(quán)利要求1所述脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，其特征在于在步驟1)中，所述細胞懸浮液的制備方法為：將正常培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細胞系HCT116細胞用胰酶消化，離心，收集細胞，正常DMEM培養(yǎng)基重懸，并將細胞濃度調(diào)整為大約2×106個細胞/mL。
4.如權(quán)利要求1所述脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，其特征在于在步驟2)中，所述配制三種碳納米管的不同濃度去離子分散液的方法為：將碳納米管溶解于濃度為5mg/mL的mPEG-pyrene中，超聲6h，10000g離心1h，取上清，同時將沉淀烘干并稱重以計算溶解的碳納米管質(zhì)量；將上清經(jīng)100kDa超濾管4000rpm離心30min去除多余的mPEG-pyrene，并用雙蒸水清洗2遍；根據(jù)烘干得到的碳納米管沉淀質(zhì)量以及最后收集得到的碳納米管溶液體積計算其濃度。
5.如權(quán)利要求1所述脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，其特征在于在步驟2)中，所述三種碳納米管的參數(shù)如下：
單臂碳納米管：純度>90％，平均直徑0.7～1.3nm，長度1μm；
雙臂碳納米管：純度>95％，平均直徑3.5nm，長度3μm；
多臂碳納米管：純度>95％，平均直徑6～9nm，長度5μm。
6.如權(quán)利要求1所述脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，其特征在于在步驟4)中，所述細胞懸浮液采用200μL細胞懸浮液。
7.如權(quán)利要求1所述脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，其特征在于在步驟5)中，所述碳納米管-細胞懸浮液采用200μL碳納米管-細胞懸浮液；所述脈沖電場的波形為矩形脈沖，脈寬800ns，場強為4kV/cm，脈沖頻率為1Hz，施加的脈沖數(shù)為10個。
8.如權(quán)利要求1所述脈沖電場聯(lián)合碳納米管在促進癌細胞凋亡中應(yīng)用的方法，其特征在于在步驟7)中，所述脈沖處理后，利用MTT法測定各處理組細胞存活率的具體方法為：脈沖處理24h后，將細胞于96孔板中培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個處理組設(shè)置6個重復(fù)，其中單獨碳納米管處理組納米管濃度為4μg/mL，24h后于各孔中加入濃度為5mg/ml的20μL MTT繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，細胞存活率％＝(處理組細胞OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)×100。
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