[發明專利]一種控制外源型添加物提高無核葡萄育種成功率的育種方法

在審

• 申請號: 201810789780.0
• 申請日: 2018-07-18
• 公開（公告）號: CN110731262A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 張莉
• 申請（專利權）人: 張莉
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H4/00;A01G2/10;A01G2/30;A01G17/02;A01C21/00
• 代理公司: 51230 成都弘毅天承知識產權代理有限公司
• 代理人: 謝建;吳靜宜

1.一種控制外源型添加物提高無核葡萄育種成功率的育種方法，其特征在于，步驟如下：

(1)試管苗的獲得：

選擇優質無核葡萄做母本，野生葡萄做父本，采取異地取粉方式；

在當地的野生葡萄父本品種開花初期，采下發育正常的花序，去除頂部發育不好的小花序以及已經展開的花朵；將保留的健康花朵取下花冠及花藥后用紗網過篩，在室溫下涼干至花藥裂開，裝入處理干凈的小瓶或光滑的紙袋中，封口，放在裝有無水CaCO3的干燥器中，4℃低溫保存，待用；

到優質無核葡萄產區選擇當地優質母本樹上發育一致的花序若干，開花前1-2天進行人工去雄，去雄時間為早晨或上午，并去除發育不良及已經打開的花朵，保證母本的純度；之后立即套袋和掛牌標記，待花朵柱頭上開始分泌水滴狀粘液時用脫脂棉蘸取備好的花粉點到柱頭上，進行人工授粉，每天1次，連續授粉2-3次，授粉后立即套袋；

授粉40-55天后，視母本胚敗育情況，從園間取回果穗，回到目標種植地區進行胚胎挽救培養；培養8周后，在無菌條件下剝取裸胚接種于胚萌發培養基中，繼續培養10-15天，轉移至成苗培養基進行繼代培養直至成苗，培養條件為溫度25℃±2℃，光照每天8h，光強度2000Lux；

(2)嫁接：

在3月將基部已經成熟的試管苗為接穗，枝條粗度1.5-2.0mm，長度3-4cm，砧木選擇當地2-3年生且長勢強的野生葡萄品種，采用常規劈接法進行嫁接，待新品種葡萄成活后命名為一號苗；

(3)二次試管苗的獲得：

選擇一號苗做母本，優質香妃葡萄做父本，采取異地取粉方式；

在優質香妃父本品種開花初期，采下發育正常的花序，去除頂部發育不好的小花序以及已經展開的花朵；將保留的健康花朵取下花冠及花藥后用紗網過篩，在室溫下涼干至花藥裂開，裝入處理干凈的小瓶或光滑的紙袋中，封口，放在裝有無水CaCO3的干燥器中，4℃低溫保存，待用；

選擇一號苗優質母本樹上發育一致的花序若干，開花前1-2天進行人工去雄，去雄時間為早晨或上午，并去除發育不良及已經打開的花朵，保證母本的純度；之后立即套袋和掛牌標記，待花朵柱頭上開始分泌水滴狀粘液時用脫脂棉蘸取備好的花粉點到柱頭上，進行人工授粉，每天1次，連續授粉2-3次，授粉后立即套袋；

授粉40-55天后，視母本胚敗育情況，從園間取回果穗，回到目標種植地區進行初次胚胎挽救培養；培養8周后，在無菌條件下剝取裸胚接種于胚萌發培養基中，繼續培養10-15天，轉移至成苗培養基進行繼代培養直至成苗，培養條件為溫度25℃±2℃，光照每天8h，光強度2000Lux；

(4)二次嫁接：

在3月將基部已經成熟的二次試管苗為接穗，枝條粗度1.5-2.0mm，長度3-4cm，砧木選擇當地2-3年生且長勢強的野生葡萄品種，采用常規劈接法進行嫁接，待新品種葡萄成活后命名為二號苗；

(5)胚胎再挽救：

以二號苗為砧木，以一號苗枝條為接穗進行第三次嫁接，用第三次嫁接成活的種苗枝條進行扦插，培育成熟，在種子最佳摘果期進行摘果，剪去果柄，自來水沖洗15-20分鐘，然后在超凈工作臺上將沖洗過的幼果先利用乙醇溶液沖洗1次，用無菌水沖洗干凈后再次放入次氯酸鈉溶液中浸泡2-3分鐘，取出后再用無菌水沖洗干凈；

(6)用消毒鍋的解剖刀切開處理后的幼果，取出胚珠，科學合理的選擇適合胚珠發育的外源物質進行培養基的配制，然后將胚珠接種到胚珠發育培養基中進行胚珠發育培養；

(7)將胚珠培養60天后，在超凈工作臺上對胚珠進行剝胚處理，科學合理的選擇適合萌發階段胚的外源物質進行培養基的配制，然后將剝離出的胚接種到胚萌發培養基中，在光照條件下進行培養30-40天，即得試管苗，最后將試管苗放入自然光下進行煉苗即可。

2.根據權利要求1所述的一種控制外源型添加物提高無核葡萄育種成功率的育種方法，其特征在于：所述初次胚胎挽救培養步驟為，首先剝取胚珠；將果穗用流水沖洗3-5分鐘，剪成3-5粒的小穗于燒杯中，置于超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡約1分鐘，無菌水沖洗3-5次，再用0.1％升汞消毒7分鐘，無菌水沖洗3-5次，切開幼果取出胚珠接種于內裝40mL培養基的100mL三角瓶中，每瓶接種10-20粒，胚珠培養基選擇適合胚珠發育的外源物質進行培養基的配制。