[發明專利]一種特異性識別妥布霉素的單鏈DNA適配體及其應用

有效

• 申請號: 201810778296.8
• 申請日: 2018-07-16
• 公開（公告）號: CN108841828B
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 周楠迪;聶晶晶;張玉紅;韓旭艷;田亞平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林

本發明公開了一種特異性識別妥布霉素的單鏈DNA適配體及其應用，屬于生物技術領域。本發明在ap32?34nt的基礎上，通過去除部分末端堿基對和不配對堿基并縮短二級結構莖區長度的方式，得到序列長度大大縮短而親和力有提高的妥布霉素適配體ap32?15nt，并將適配體ap32?15nt用于多種妥布霉素檢測方法和檢測試劑的構建，適配體具有親和力高、特異性高、結構穩定等優點，所建立的檢測方法具有檢測周期短，靈敏度高，成本低，特異性強等優點。

技術領域

本發明涉及一種特異性識別妥布霉素的單鏈DNA適配體及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

妥布霉素屬于氨基糖苷類抗生素，是一類廣譜抗菌藥，其抗菌效果好，適于治療呼吸、消化、泌尿、生殖系統的各種感染癥狀，廣泛應用于動物和水產養殖業中。由于妥布霉素屬于人獸共用藥，其毒副作用除對人體有直接損害以外，食品和環境中殘留的妥布霉素最終也會影響人類的健康安全。傳統的抗生素殘留檢測方法有微生物檢測法和儀器分析法，包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、液-質聯用儀法(HPLC-MS)、液相色譜-串極質譜法(HPLC-MS/MS)等。微生物檢測法應用較為廣泛，其優點是費用低，一般實驗室都能操作，但測定時間長，結果誤差較大，操作復雜，因此不能適應高通量高靈敏定量檢測的需求。而儀器分析方法靈敏度高，準確性好，但往往設備昂貴，對實驗人員也有較高的要求，對樣品的預處理要求較高，分析費時而不易推廣，難以滿足現場檢測的需要。免疫分析法是利用抗原抗體特異性結合反應檢測各種物質，在食品抗生素殘留檢測領域已較為廣泛地應用。酶聯免疫吸附測定(ELISA)將抗原和抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結合，有效保證分析中的高選擇性和高靈敏度，報道最多的是免疫分析方法。目前市場上已有一些針對抗生素殘留檢測的ELISA試劑盒產品，不過價格昂貴，酶標抗體的種類有限，只能檢測少數種類常見的抗生素殘留。由于抗生素是小分子化合物，本身不具有免疫原性，生產與應用存在較多的限制，包括：抗原制備中免疫原性弱的抗生素半抗原難以產生高效價的抗體；產生于鼠、兔等動物的異源抗體在使用中有可能產生非特異性反應(假陽性)；抗體的制備成本高，費時費力，克隆株不易保存；批間質量不一；抗體的活性難以長時間保持，對溫度敏感，易發生不可逆變性。這些都在很大程度上限制了免疫分析方法在抗生素檢測中的應用。

SELEX技術是一種利用隨機寡核苷酸文庫在體外篩選能與各種配體特異性結合的寡聚核苷酸片段的組合化學技術，該技術對靶分子無特殊要求，可以是蛋白質、核酸、寡肽、小分子有機物甚至是金屬離子，篩選出的寡核苷酸被稱為適配體。由于適配體在多個方面的優勢，已被廣泛用作生物傳感分析中靶分子特異性的識別元件。但通過SELEX篩選得到的適配體序列一般比較長，增加了適配體構象的不確定性，不利于其在不同溶液環境中與靶分子的穩定結合，也提高了合成成本。利用基于結構分析的理性設計可以對適配體序列進行截短優化，保留其與靶分子結合的位點，刪除大量冗余序列，能夠大大降低合成成本。但是在截短過程中，往往會破壞原有序列的二級結構，親和力、靈敏度等會降低。

本實驗室前期研究利用磁珠SELEX篩選得到的長度為79個核苷酸的妥布霉素適配體ap32，從適配體ap32出發，通過二級結構分析和理性設計對ap32序列進行截短優化，得到一段核苷酸長度僅為34的適配體ap32-34nt，但是適配體ap32-34nt的親和力有所降低。

發明內容

為解決上述問題，本發明在ap32-34nt的基礎上，通過去除部分末端堿基對和不配對堿基并縮短二級結構莖區長度的方式，得到序列長度大大縮短而親和力有提高的妥布霉素適配體ap32-15nt。

本發明的第一個目的是提供一種特異性識別妥布霉素的單鏈DNA適配體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述適配體的3’端或5’端修飾功能基團或分子。

在本發明的一種實施方式中，修飾后的適配體與上述的適配體具有相同功能的適配體。