[發明專利]一種能降解利用餐廚廢棄物生成乳酸的基因重組畢赤酵母

有效

• 申請號: 201810772223.8
• 申請日: 2018-07-13
• 公開（公告）號: CN109097293B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 劉澤寰;林蔣海;雷森林;李帥
• 申請（專利權）人: 廣東利世康低碳科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/56;C12R1/84
• 代理公司: 廣州潤禾知識產權代理事務所(普通合伙) 44446
• 代理人: 周鄭奇;林名欽

本發明公開了一種能降解利用餐廚廢棄物的基因工程畢赤酵母及其構建方法。本發明將α?淀粉酶基因、糖化酶基因和乳酸脫氫酶基因通過畢赤酵母表達載體pTEFZαA整合至畢赤酵母基因組上構建而成。本發明構建的畢赤酵母發酵生產乙醇的能力低，可以減少碳源的流失，減少副產物的生成，增加乳酸的產率。其次，在發酵生產乳酸的過程中，無需另外添加商業化淀粉水解酶，簡化了在發酵餐廚廢棄物過程中的實際操作步驟，也降低了生產成本，更適用于工業化運用。

技術領域

本發明涉及遺傳工程及發酵工程領域，尤其涉及一種能降解利用餐廚廢棄物生成乳酸的基因重組畢赤酵母及其構建方法。

背景技術

餐廚廢棄物又稱泔水、潲水，是居民在生活消費中形成的廢棄物，其主要含有動物肉類，蔬菜，油脂，面包，米飯等。在化學成分上，主要含有蛋白質，脂肪，淀粉，纖維素等成分，其營養豐富，極易滋生金黃色葡萄球菌，沙門氏菌等多種病原微生物，餐廚廢棄物腐爛后會發出惡臭，對周圍的空氣造成污染。據統計，全球每年約有4億噸餐廚廢棄物產生，造成的浪費高達7,500億美元，而且，隨著經濟的不斷發展，餐廚廢棄物的量在每年遞增。餐廚廢棄物的產生集中在城市的飯店、學校食堂等地方。但是，目前大部分的餐廚廢棄物被用來喂豬、填埋，甚至制造“地溝油”，造成了嚴重的環境污染，僅少部分得以合理利用，比如焚燒、堆肥和沼氣等等，但經濟效益低下。因此，尋找一種能將餐廚廢棄物進行充分資源化利用的辦法，是餐廚廢棄物處理面臨的重要課題。

乳酸在食品，化妝品，藥品以及工業上均有廣泛的應用，使得乳酸的需求量在逐年上升，從2010年到2016年全球乳酸需求量從480,000噸上升到1,070,000 噸，平均每年上升14.2％。目前乳酸的生產大都是以糧食為原料，成本高，所以降低乳酸的生產成本是非常有必要的。利用餐廚廢棄物生產高價值產品乳酸，不僅可以解決餐廚廢棄物帶來的環境污染問題，還可以變廢為寶，具有巨大的社會效益。

畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種甲醇營養性酵母，可以利用甲醇作為唯一碳源生長。生物量高，是最成功的外源蛋白表達宿主之一。其具有以下幾個優點： (1)畢赤酵母屬于克雷布特效應陰性菌(Crabtree-negative)，在富含葡萄糖的培養基中生長時，呼吸作用不受抑制，不產生乙醇，在嚴格好氧的條件下能夠快速生長；(2)畢赤酵母屬于單細胞生物，易滿足于低營養條件，生長速度快，操作簡便，高密度培養工藝成熟，已能應用于工業化大規模生產的發酵罐培養，細胞干重達到150g/L；(3)外源基因的表達通常通過基因組整合的方式整合在畢赤酵母基因組上，遺傳穩定，連續培養50代外源基因遺傳依然穩定；(4)外源蛋白表達量高，且自身分泌蛋白量少；(5)有完善的翻譯后修飾系統，能保證外源蛋白表達的活性。

但是畢赤酵母缺乏有效降解淀粉生成葡萄糖，并將葡萄糖轉化成乳酸的酶，在自然條件下，畢赤酵母不能直接利用餐廚廢棄物中的淀粉用于生產乳酸。因此為了以餐廚廢棄物作為原料發酵生產乳酸，必須通過基因工程，將降解淀粉和生產乳酸的基因導入畢赤酵母中，以彌補其降解餐廚廢棄物和成產乳酸的缺陷。使重組畢赤酵母可以利用自身合成的淀粉酶將淀粉降解成可利用的碳源，并在乳酸脫氫酶的作用下，打通畢赤酵母乳酸合成途徑，最終得到目標產物乳酸。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種能降解利用餐廚廢棄物生成乳酸的基因重組畢赤酵母。

為了解決上述技術問題，本發明采用如下方案實現：

一種基因重組畢赤酵母，將α-淀粉酶基因(α-amylase，Amy)、糖化酶基因(glucoamylase，Ga)和乳酸脫氫酶基因(lactate dehydrogenase，LDH)通過畢赤酵母表達載體(pTEFZαA)整合至畢赤酵母基因組上構建而成。

所述畢赤酵母表達載體pTEFZαA為以畢赤酵母表達載體pGAPZαA為基礎，以畢赤酵母的轉錄延伸因子1-α啟動子(TEF)SEQ ID NO.1替換畢赤酵母表達載體pGAPZαA的畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子而得。包括如下步驟：