[發(fā)明專利]石油污染厭氧環(huán)境中石油烴厭氧降解基因bamA含量的測(cè)定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810767132.5
• 申請(qǐng)日: 2018-07-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110714059A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋本如;唐景春;甄梅楠;劉小妹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開(kāi)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/64
• 代理公司: 12214 天津創(chuàng)智天誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 李蕊;田陽(yáng)

1.一種石油污染厭氧環(huán)境中石油烴厭氧降解基因含量的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)獲得能在厭氧環(huán)境中降解石油烴菌株的降解基因的DNA序列，根據(jù)降解基因的DNA序列利用Primer express軟件遵循引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)出降解基因的簡(jiǎn)并性擴(kuò)增引物的序列并合成該簡(jiǎn)并性擴(kuò)增引物，其中，所述降解石油烴菌株的降解基因?yàn)閎amA；

2)取得含有步驟1)中降解基因的陽(yáng)性樣品，提取所述陽(yáng)性樣品中所有微生物的DNA；通過(guò)PCR儀利用步驟1)所得簡(jiǎn)并性擴(kuò)增引物以所述微生物的DNA作為DNA模板進(jìn)行降解基因的PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)將步驟2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否得到特異性條帶，如得到特異性條帶，則進(jìn)行切膠回收，再將特異性條帶導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的感受態(tài)細(xì)胞接種到LB固態(tài)培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，然后進(jìn)行藍(lán)白斑陽(yáng)性克隆子的篩選，通過(guò)挑選得到含有重組質(zhì)粒的白色單菌落，將白色單菌落接種到LB液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌液；

4)對(duì)步驟3)所得菌液的特異性條帶進(jìn)行測(cè)序，判斷測(cè)序結(jié)果是否為步驟1)所得降解基因的序列，如測(cè)序結(jié)果為步驟1)中的降解基因的序列，則將步驟3)所得菌液提取重組質(zhì)粒；

5)使用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定降解基因的重組質(zhì)粒的濃度X，通過(guò)公式(1)計(jì)算得到每微升重組質(zhì)粒中降解石油烴菌株的降解基因的拷貝數(shù)CN，

CN＝[(X/(T_p+b)/660)]×10^-9×6.02×10²³； (1)

其中，b為降解石油烴菌株的降解基因的片斷長(zhǎng)度，660為每對(duì)堿基的平均分子量(單位：Da)；6.02×10²³為阿伏伽德羅常量(單位：mol^-1)，T_p為將特異性條帶導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞所采用克隆試劑盒中載體的序列長(zhǎng)度；

將重組質(zhì)粒按照10倍梯度依次稀釋N次，N大于等于6，得到1個(gè)重組質(zhì)粒和N個(gè)稀釋后重組質(zhì)粒，通過(guò)計(jì)算得到N個(gè)稀釋后重組質(zhì)粒每微升中降解基因的拷貝數(shù)CN；

6)將步驟5)所得1個(gè)重組質(zhì)粒和N個(gè)稀釋后重組質(zhì)粒作為DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR，得到1個(gè)重組質(zhì)粒和N個(gè)稀釋后重組質(zhì)粒的循環(huán)閾值Ct；

7)以lg(CN)值為X軸，以循環(huán)閾值Ct為Y軸，建立坐標(biāo)系，將1個(gè)重組質(zhì)粒和N個(gè)稀釋后重組質(zhì)粒的lg(CN)值和循環(huán)閾值Ct繪入坐標(biāo)系中，形成一標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，所述lg(CN)值和循環(huán)閾值Ct不成線性比例的最大Ct值所對(duì)應(yīng)lg(CN)值為所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)下限，獲得該標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性比例部分線段的公式為所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式；

8)通過(guò)熒光定量PCR確定待測(cè)樣品的循環(huán)閾值Ct，將所述循環(huán)閾值Ct代入步驟7)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式，得到待測(cè)樣品的降解基因的拷貝數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，

在所述步驟1)中，通過(guò)Primer express軟件得到：