[發(fā)明專利]構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810763745.1
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN109266601A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設計）人: 焦陽;王鐵;叢昊
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇瑞思坦生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 邢若蘭;高之波

本發(fā)明公開了構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法，該方法包括如下步驟：步驟a、脂肪組織經(jīng)處理，獲得含脂肪干細的凍存液；步驟b、獲得SVF細胞，脂肪組織經(jīng)洗滌、消化、分離獲得SVF細胞；步驟c、脂肪干細胞培養(yǎng)，將SVF細胞接種到完全培養(yǎng)基中，當細胞匯合達到80％左右時吸棄培養(yǎng)基，洗滌后，加入胰酶，在貼壁細胞分離后終止胰酶作用，其后進行傳代培養(yǎng),得到臨床用脂肪干細胞庫；本發(fā)明的構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法方法高效穩(wěn)定構(gòu)建的脂肪干細胞庫安全性高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于人體干細胞，特別涉及脂肪干細胞。

背景技術(shù)

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、ADSC多能細胞是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。主要恢復組織細胞的修復功能，促進細胞的再生，恢復年輕面容的同時，身體機能也得到充分改善，有效改善亞健康、早衰等疾病，由內(nèi)而外真正的有效抵抗衰老。

SVF(Stromal Vascular Fraction)，中文名血管基質(zhì)組分，是通過通過抽脂、消化、離心等步驟，從脂肪組織中分離出的多種細胞混合物形成的細胞團。SVF中包含數(shù)量豐富的間充質(zhì)干細胞(ASCs)、高濃度血小板血漿(PRP)、生長因子、紅細胞、白細胞、淋巴細胞、單核細胞等。研究發(fā)現(xiàn)，新鮮分離的SVF中的各種細胞之間有一種協(xié)同效應，他們之間相互影響并通過自分泌，增加組織的修復能力和創(chuàng)面愈合能力，安全性、有效性極高。SVF來源的脂肪干細胞建立的臨床用脂肪干細胞庫目前研究較少質(zhì)量不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述現(xiàn)有各種方法的不足，本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法，該方法包括如下步驟：

步驟a、脂肪組織經(jīng)處理，獲得含脂肪干細的凍存液；

步驟b、獲得SVF細胞，脂肪組織經(jīng)洗滌、消化、分離獲得SVF細胞；

步驟c、脂肪干細胞培養(yǎng)，將SVF細胞接種到完全培養(yǎng)基中，當細胞匯合達到80％左右時吸棄培養(yǎng)基，洗滌后，加入胰酶，在貼壁細胞分離后終止胰酶作用，其后進行傳代培養(yǎng),得到臨床用脂肪干細胞庫；

根據(jù)本發(fā)明一方面，提供一種構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法，在上述步驟c后細胞還可以進行存儲。

根據(jù)本發(fā)明一方面，提供一種構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法，脂肪干細的凍存液的凍存方法為：取預冷的凍存盒、凍存液以及凍存管，加適量體積的凍存液至含有細胞的離心管中，輕輕沿管壁緩緩滴入10滴，輕輕晃動離心管混勻細胞，再加入余下的凍存液，每凍存管加入1.5ml凍存液，旋緊管蓋置于已預冷的加入異丙醇的程序降溫和中，迅速置入-80℃冰箱過夜，次日移入液氮罐。

根據(jù)本發(fā)明一方面，提供一種構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法，其中凍存液為：DMSO滴加入無血清培養(yǎng)基而配制成10％DMSO濃度的細胞凍存液。

根據(jù)本發(fā)明一方面，提供一種構(gòu)建臨床脂肪干細胞庫的方法，步驟b獲得SVF細胞的方法為：

配制脂肪組織消化劑溶液：根據(jù)脂肪標本的量，配制一定體積的人脂肪組織消化劑溶液，無菌過濾器過濾除菌，待用；

QC檢測：QC從標本中取少許廢液于凍存管留樣凍存，另取一營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，加少量標本廢液做無菌檢測；

洗滌脂肪組織：向脂肪標本儲液瓶中加入標本洗滌液，重復3～4次，直到洗出的廢液澄清為止；

消化脂肪組織：將洗滌后的脂肪均等的分裝到離心管中，每個管中加入等量的人脂肪組織消化酶，無菌情況下置入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中消化30～60min。