[發明專利]一種測定生物樣品中姜黃素和紫杉醇含量的HPLC分析方法

有效

• 申請號: 201810761716.1
• 申請日: 2018-07-12
• 公開（公告）號: CN109100435B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 趙領;魏郁夢;皮超;李蘭梅;郭璞;袁紀元;黃紹秋;趙仕杰;鄒永根;楊紅茹
• 申請（專利權）人: 西南醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.一種測定生物樣品中姜黃素和紫杉醇含量的HPLC分析方法，依次包括標準曲線的建立和樣品檢測兩個步驟，其特征在于，HPLC分析方法的條件為：采用4.6 mm × 250 mm的Luna ? 5 μm C18色譜分析柱，采用梯度洗脫變波長方法：0 ~ 9.5 min時，檢測波長為425nm，流動相為乙腈和磷酸緩沖液，乙腈和磷酸緩沖液的體積比為55:45；9.51 ~ 11.5min時，檢測波長為227 nm，流動相為乙腈和磷酸緩沖液，乙腈和磷酸緩沖液的體積比為40:60；柱溫30℃，流動相流速為1 mL / min；所述磷酸緩沖液是由磷酸和三乙胺配制的pH=3.5的混合液；

還包括待測樣本制備步驟，具體操作如下：向血漿樣品或者勻漿后的動物組織樣品中加入檸檬酸緩沖液，混合均勻，加入8～12倍的體積的萃取溶劑，混勻并離心，取有機層，氮氣揮干，加入復合溶劑，混勻，離心取上清液即為供試液；所述萃取溶劑為乙酸乙酯和甲醇配制而成，兩者的體積比為90:10。

2.如權利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述HPLC分析方法的條件還包括：在11.51 ~ 19.0 min時，檢測波長為425 nm，流動相為乙腈和磷酸緩沖液，乙腈和磷酸緩沖液的體積比為55:45。

3.如權利要求1或2所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述標準曲線的建立包括以下步驟：

（1）對照品溶液的配制：將姜黃素、紫杉醇及姜黃素和紫杉醇分別溶于甲醇，制備成相同濃度的姜黃素儲備液、紫杉醇儲備液及姜黃素和紫杉醇混合儲備液，再用甲醇稀釋為系列梯度濃度的標準溶液；

（2）標準曲線的建立：分別取系列濃度的姜黃素、紫杉醇及姜黃素和紫杉醇混合的標準溶液與待測樣品對應的空白生物樣品混合得混合液，并對混合液進行樣品前處理得供試液，然后在所述HPLC分析方法的條件下利用HPLC測定含量，以樣品濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸，建立標準曲線。

4.如權利要求3所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述樣品檢測步驟為取待測樣品進行樣品前處理得到供試液，然后在所述的HPLC分析方法的條件下利用HPLC測定含量，根據上述標準曲線和峰面積計算樣品中姜黃素和紫杉醇的濃度。

5.如權利要求4所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述復合溶劑為乙腈和磷酸緩沖液配制而成，兩者體積比為75:25。

6.如權利要求5所述的HPLC分析方法，其特征在于，樣品前處理的具體方法如下：

取定量混合液置于5 mL 離心管中，加入25 μL pH 3.6的 CA 緩沖液，渦旋混合30 s，加入定量萃取劑，萃取劑是體積比為90：10的乙酸乙酯和甲醇，渦旋3 min，8000 rpm/min離心3 min，取上清液；再次加入萃取劑重復萃取一次，合并2 次上清液；氮氣吹干，加入200 μL 復合溶劑，復合溶劑是乙腈和pH 3.5的磷酸，渦旋混合4 min，超聲4 min，10000 rpm/min離心10 min，取上清液20 μL 進行HPLC 檢測。

7.如權利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述待測樣品為家兔樣品時，所述標準溶液與空白生物樣品的體積比為1:10，所述待測樣品為大鼠樣品時，所述標準溶液與空白生物樣品的體積比為1:2。