[發明專利]一種Vip3Aa20兔多克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201810746540.2
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN108892724A
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 劉衛曉;金蕪軍;李亮;宛煜嵩;黃衛紅;苗朝華;高進;董美;王迪;張哲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/06;G01N33/68
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

本發明公開了屬于生物工程技術領域的一種Vip3Aa20兔多克隆抗體的制備方法，所述多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：a)通過原核表達得到Vip3Aa20重組蛋白；b)免疫動物：將Vip3Aa20重組蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔；c)效價檢測；d)多克隆抗體純化及western驗證。所述多克隆抗體為實現抗蟲蛋白Vip3Aa20在轉基因玉米MIR162中的定性、定量檢測奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及到一種Vip3Aa20兔多克隆抗體的制備方法。

背景技術

蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性菌，在營養生長期分泌具有高抗蟲活性的可溶蛋白(Vegetative InsecticidalProteins,Vip proteins)。在接種15個小時至產孢期，菌液上清均可檢測到Vip3蛋白的表達。抗蟲蛋白Vip3對鱗翅類(Lepidoptera)昆蟲有廣泛毒性，當昆蟲取食Vip3蛋白后，該蛋白經中腸蛋白酶活化，活化的蛋白穿透圍食膜，與中腸細胞的上皮細胞頂膜特異蛋白結合并形成腸穿孔，從而破壞細胞的滲透平衡，引起細胞腫脹裂解，最終導致死亡。因此Vip3基因已成為植物基因工程及轉基因育種應用中最具有潛力和應用前景的抗蟲基因。其中Vip3Aa基因已成功的被用于轉基因棉花和玉米。

轉基因作物的飛速發展在帶來巨大經濟利益的同時，人們也越來越關注轉基因作物可能帶來的不可預期的食用安全及環境安全性問題，越來越多的國家要求對轉基因產品進行檢測以實行標識制度。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種Vip3Aa20兔多克隆抗體的制備方法，得到其的多抗為實現抗蟲蛋白Vip3Aa20在轉基因玉米MIR162中的定性、定量檢測奠定基礎。

為實現上述目的，本發明提供了一種Vip3Aa20多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

a)通過原核表達得到Vip3Aa20重組蛋白；

b)免疫動物：將Vip3Aa20重組蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔；

c)效價檢測：采用間接ELISA法，對抗體進行梯度稀釋并檢測抗體的效價和靈敏度；

d)多克隆抗體純化：采用Protein G親和層析，得到多克隆抗體。

上述多克隆抗體通過間接ELISA檢測所得到的效價依次為1:512000。

本發明還提供了上述多克隆抗體在檢測Vip3Aa20抗蟲蛋白中的應用。

本發明還提供了上述多克隆抗體在制備ELISA法檢測Vip3Aa20抗蟲蛋白的試劑中的應用。

本發明還提供了上述多克隆抗體在制備ELISA雙抗體夾心法檢測Vip3Aa20抗蟲蛋白的試劑中的應用。

本發明的有益效果：本發明利用工程菌株表達、純化得到的高純度抗蟲蛋白Vip3Aa20作為抗原，通過免疫日本大耳白兔獲得抗血清純化后得到的抗體間接ELISA效價為1:512000，所述多克隆抗體可以特異識別原核表達的重組Vip3Aa20蛋白及轉基因玉米MIR162標準品中的內源Vip3Aa20蛋白，Vip3Aa20抗蟲蛋白的兔多克隆抗體的構建為轉基因作物中該蛋白的檢測提供了物質和技術支撐。

附圖說明

圖1是Vip3Aa20重組蛋白SDS-PAGE電泳結果圖。

圖2是Vip3Aa20重組蛋白多克隆抗體western結果圖，二抗:IgG(H+L)-HRP(1:5000)。