[發明專利]鑒別或輔助鑒別黃芪的引物對及其應用

有效

• 申請號: 201810745789.1
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN109735643B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 王繼永;鄭司浩;李進瞳;尚興樸;劉美娟;曾燕;孫赫赫
• 申請（專利權）人: 中國中藥有限公司;國藥種業有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京知聯天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11594
• 代理人: 王沖;吳鑫

本發明涉及鑒別或輔助鑒別黃芪的引物對及其應用，該引物對可用于對蒙古黃芪與膜莢黃芪進行鑒別。

技術領域

本發明涉及一種鑒別或輔助鑒別黃芪的引物對及其應用，該引物對可用于對蒙古黃芪與膜莢黃芪進行鑒別。

背景技術

黃芪為豆科黃耆屬藥材，《中國藥典》規定黃芪藥材植物來源為蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。膜莢黃芪資源分布較為廣泛，多分布于黑龍江、華北及西北等地區，蒙古黃芪的產地變遷較為復雜，目前多在山西、內蒙古、陜西等地栽培分布。

目前市場上蒙古黃芪與膜莢黃芪的種源混亂，嚴重影響了中藥產業的發展。傳統的形態等鑒別方法很難準確鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪，例如，從植物外觀形態，主要是葉片的形狀及數量等，可以初步鑒別膜莢黃芪與蒙古黃芪，但若從種子外觀形態及藥材的性狀來看，則很難對膜莢黃芪與蒙古黃芪作以區分。

分子標記技術如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA標記)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性)、SSR(Simple Sequence Repeat，簡單重復序列標記)等結果可重復性差、工作量大、成本高。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指發生在染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性。在漫長的進化過程中，生物體形成了自身特有的DNA堿基序列，比較不同物種間或同一物種不同地方品種間的SNP差異，可以了解物種間的親緣關系和進化的生物信息學，從而對不同物種或同一物種不同地方的品種進行精細鑒定和分類。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，單個核苷酸多態性標記可幫助區分個體間遺傳物質的差異。

發明內容

本發明涉及一種基于單核苷酸多態性標記的鑒別或輔助鑒別黃芪的方法，運用分子生物學的分子標記技術，對不同基原的黃芪植物樣本進行DNA提取，PCR擴增，引物篩選及生物信息學分析，找到快速準確鑒別不同基原黃芪(蒙古黃芪與膜莢黃芪)的方法。

發明人通過大量閱讀文獻以及實地調研等方式確定蒙古黃芪與膜莢黃芪的主產區。蒙古黃芪的主產區為山西、內蒙古等地，膜莢黃芪的主產區為山西、吉林等地。通過深入黃芪主產區，與當地種植大戶溝通，采集了大量正品的蒙古黃芪與膜莢黃芪野生與栽培樣本。

通過對采集的樣本進行DNA提取，運用不同的序列引物進行PCR擴增，并測序，通過生物信息學分析比對序列，篩選的序列包括核基因序列ITS(Internal transcribedspacer，內轉錄間隔區)與ITS2(Internal transcribed spacer 2)，葉綠體基因序列psbA-trnH(主要是指psbA與tRNA-His intergenic spacer region間隔區序列)、rbcL(ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)、matK(maturase K)。

運用MEGA軟件進行序列比對與分析，找到可以穩定準確鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪的引物序列(在該序列某一位點或某幾個位點，蒙古黃芪與膜莢黃芪樣本的堿基均不一樣，且各自一致)。通過最終數據比對篩選，發現核基因ITS序列可以將膜莢黃芪與其變種蒙古黃芪進行鑒別。經過序列比對分析，發現在ITS序列中的476位點(ITS序列為獨立的序列，有其固定的組成部分，為ITS1、5.8S、ITS2，雖然不同物種之間各組成部分的長度不同，但同一物種或其近緣種ITS序列的長度是基本一致的。而且通過MEGA軟件進行序列比對后，每條序列的堿基均相對應，保證每條序列都是在476位點處產生堿基突變)，呈現規律性的突變堿基(Single Nucleotide Polymorphisms，單核苷酸多態性，SNP變異位點)。蒙古黃芪在ITS序列的476位點為C堿基，膜莢黃芪在ITS序列的476位點為T堿基(如圖1所示)。