[發明專利]生物活性肽kss1b及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201810744908.1
• 申請日: 2018-07-09
• 公開（公告）號: CN108840910B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 袁維峰;侯紹華;賈紅;郭曉宇;鑫婷;朱鴻飛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/70;C12N15/62;C07K1/20;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發明屬于多肽制備技術領域，具體公開了生物活性肽kss1b及其制備方法與應用。本發明通過選擇合適的表達菌株以及合適的載體，并采用自動誘導的方式，提供了一種較為理想的利用大腸桿菌來進行kss1b的重組表達方案。使用該方法能夠穩定獲得1mg/L的高純度的重組kss1b(rkss1b)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。rkss1b能夠在1μM水平，顯著抑制大鼠DRG細胞上的TTX?S型電壓敏感鈉通道(VGSC)電流。

技術領域

本發明屬于多肽制備技術領域，具體地說，涉及生物活性肽kss1b及其制備方法與應用。

背景技術

中藥蜈蚣是使用蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣的全體，其入藥的主要活性組分為蜈蚣毒素。該蜈蚣毒素有較高的藥用價值，具有攻毒散結、熄風鎮痛、抗癌等功能，其藥用價值被國內外醫學專家高度重視。蜈蚣毒素中有相當多的多肽小分子，具有不同的生理活性，是潛在的藥用分子，但是相較蝎子毒素，我國對于單一的源自蜈蚣的活性多肽分子的活性研究較少。

kss1b是從少棘蜈蚣的cDNA文庫中獲得的毒素，它與鉀通道抑制劑kss1a同源，由50個氨基酸殘基構成，含有3對二硫鍵的多肽分子，推測其可抑制大鼠背神經節中的鉀通道電流，可能是一種潛在的神經多肽藥物。此外，可通過對比kss1b與kss1a的活性與氨基酸序列，來對作用鉀通道的關鍵氨基酸殘基進行分析確定，從而開發獲取更高效專一的鉀通道調節劑，使得開發更有效的神經多肽藥物成為可能。同時，通過kss1b毒素多肽的制備獲得，可進一步探究kss1b與kss1a的活性關聯，從進化學角度來對蜈蚣毒素有更加深層次的認識。為了更好的研究和開發蜈蚣毒素，使其直接成藥或者作為藥物先導分子開發，勢必需要制備一批高純度的kss1b多肽以供研究。

kss1b對應的氨基酸序列為：ANDKPIGKCGDAKRNKPCLACSHRSSIADFYSKCCTYDAVYNGCLDKLRH(SEQ ID NO.11)。獲取kss1b一般通過化學合成或者利用微生物進行異源表達。根據發明人多年的多肽制備經驗，氨基酸長度在30個以上，同時含有多對二硫鍵的小分子多肽，如果采用化學合成的路線，因需要反復的變復性(形成二硫鍵)和純化，導致其成本相當昂貴；利用微生物進行重組表達則成本相對低廉很多。而通過微生物獲取工業級別的大量重組多肽，只能是通過大腸桿菌或者畢赤酵母。但是使用畢赤酵母，存在產物均一化程度不高的問題，而且相對大腸桿菌制備，有更高的技術門檻。目前還沒有使用大腸桿菌來制備kss1b的報道，對其活性更加無從談起。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供生物活性肽kss1b及其制備方法與應用。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

第一方面，本發明提供一種生物活性肽kss1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本發明通過通過全細胞膜片鉗實驗研究發現，SEQ ID NO.11所示的生物活性肽kss1b，能夠在1μM水平下，顯著抑制大鼠DRG細胞上的TTX-S型電壓敏感鈉通道(VGSC)電流。

第二方面，本發明提供了所述生物活性肽kss1b的制備方法，具體為：通過構建生物活性肽kss1b的表達載體，將其轉入大腸桿菌中，誘導表達含有kss1b的融合蛋白，提取后經處理獲得生物活性肽kss1b，純化即得。

作為優選，所述大腸桿菌采用SHuffle^TM，該菌株作為表達菌株，能提供其他大腸桿菌無法提供的胞內氧化環境，使得含有三對二硫鍵的kss1b能夠正確形成二硫鍵，獲得正確折疊的kss1b。

作為優選，本發明所述生物活性肽kss1b的表達載體包括如下自上游至下游的片段：編碼6×His的序列、編碼SUMO的序列、編碼生物活性肽kss1b的序列；其中，編碼6×His的序列如SEQ ID NO.1所示，編碼SUMO的序列如SEQ ID NO.2所示，編碼生物活性肽kss1b的序列如SEQ ID NO.3所示。