[發明專利]一組GPV和N-GPV通用型檢測引物和探針

在審

• 申請號: 201810739836.1
• 申請日: 2018-07-06
• 公開（公告）號: CN108823332A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 萬春和;黃瑜;陳翠騰;傅秋玲;程龍飛;傅光華;施少華;陳紅梅;劉榮昌
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供一組GPV和N?GPV通用型檢測引物和探針，所述引物和探針序列如下：上游引物NGG?F：5’?TAGGGAGGAGTTAGAAGA?3’；下游引物NGG?R：5’?CATCCATAGAATTGTCATAAGTA?3’；所述探針NGG?P序列為：5’?ACCTGGTAATTGTTCCTG CTTCTCT?3’，其5’?端標記熒光報告基團FAM，3’?端標記熒光淬滅基團Eclipse。該方法靈敏度高、穩定性好、特異性強、重復性好，可檢測N?GPV感染，為后續研究N?GPV的致病機理和開展分子流行病學奠定基礎。

技術領域

本發明涉及一組GPV和N-GPV通用型檢測引物和探針，屬于禽病學領域。

背景技術

實時熒光定量PCR方法（qPCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系。熒光探針法是用序列特異的熒光標記探針來檢測產物，探針法的出現使得定量PCR技術的特異性比常規PCR技術大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交探針（熒光共振能量傳遞探針）和分子信標（molecular Beacon）。TaqMan探針法是指qPCR 擴增時在加入一對引物時，還同時另外加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有熒光報告基團(Reporter，R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端標記有熒光淬滅基團，如Eclipse、TAMRA、BHQ等。當探針完整的時候，5′端報告基團經儀器光源激發的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發的熒光信號。隨著qPCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會切割探針，釋放5′端報告基團游離于反應體系中，遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，5′端報告基團受激發所發射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與qPCR產物形成完全同步，報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。由于TaqMan實時熒光定量探針在常規SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法的基礎上，加入一條更特異性的探針，使檢測目的基因只有和TaqMan探針特異性的結合，才能檢測到陽性擴增信號，使檢測結果更特異性，避免了SYBR GreenⅠ實時熒光定量方法可能導致的結果誤讀誤判，被廣泛應用于病原學檢測領域。

鵝細小病毒（Goose parvovirus, GPV）為無囊膜、正二十面體對稱、單股DNA病毒；其基因組全長均為5.1Kb左右。研究發現，其基因組在5’-末端（terminal）和3’-末端均為含有發夾結構（hairpin structure）的末端重復序列（inverted terminal repeat，ITR），以及2個大的開放閱讀框（ORF）組成。左側的ORF編碼病毒復制相關蛋白NS，右側的ORF編碼病毒抗原相關蛋白VP（VP蛋白可經不同的切割形成3個主要抗原蛋白VP1、VP2和VP3），VP2、VP3與VP1共同使用相同的3’-末端和同一終止密碼子。2015年以來我國多地櫻桃谷鴨、北京鴨和半番鴨出現以上喙變短、舌頭伸出為典型特征，由新型鵝細小病毒（novel GPV，N-GPV）感染所致的短喙與侏儒綜合征（short beak and dwarfism syndrome，SBDS），并對家養水禽表現出廣泛的致病性(Chen H, et al. Isolation and genomic characterization of aduck-origin GPV-Related Parvovirus from Cherry Valley ducklings in China.PLoS One, 2015, 10: e0140284.)。經過流行病學調查發現，GPV和N-GPV在致病型和宿主上存在差別：GPV可感染鵝和番鴨（偶見可感染天鵝和鴻雁）；N-GPV可感染北京鴨、櫻桃谷鴨和半番鴨。