[發明專利]一種大腸桿菌壓力響應型啟動子及其制備方法

有效

• 申請號: 201810738211.3
• 申請日: 2018-07-06
• 公開（公告）號: CN108866057B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 康振;劉慶濤;翁煥嬌;王陽;陳堅;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種大腸桿菌壓力響應型啟動子及其制備方法，屬于啟動子工程領域。本發明以pColaDuet?GFP質粒為模板，通過設計兼并引物對不同σ因子識別的啟動子的保守序列進行串聯，對其間隔序列進行隨機突變，以綠色熒光蛋白GFP為報告基因，篩選到多個在低溫，高滲透壓，低PH條件下都有較高表達強度的啟動子。

技術領域

本發明涉及一種大腸桿菌壓力響應型啟動子及其制備方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

作為原核生物，大腸桿菌遺傳背景清晰，基因操作簡單，且生長周期短，可實現高密度發酵等使得它具有原核表達系統的許多優點。目前大腸桿菌已廣泛用于基礎研究及大規模的工業化生產，主要體現在用于外源蛋白的表達、代謝途徑重構生產有價值的目的產物等。其表達系統中強啟動子的應用對于外源蛋白的高效表達起到關鍵作用。

為了提高目的產物產量，代謝工程中常用的手段是利用強啟動子過量表達合成代謝途徑中關鍵酶的編碼基因，但大腸桿菌中啟動子活性較強的大多為誘導型啟動子(如T7啟動子)。誘導表達過程中需添加誘導劑，不適于大規模生產，還可能對細胞具有一定的毒性。細胞對誘導劑感應也存在非均一性，即誘導物濃度效應往往只是增加群體中基因表達的細胞數而非各單個細胞的表達水平，不具有表達的均一性。并且為了細胞在不同的環境條件下(如低溫、高鹽濃度、低pH等)，均能高強度地表達外源蛋白，構建一種能夠強自誘導型啟動子對于擴展大腸桿菌的工業化應用具有重大意義。

發明內容

為了解決大腸桿菌在不同環境下均無需添加誘導劑高強度表達外源基因的問題，本發明提供了大腸桿菌壓力響應型啟動子及其制備方法。所述壓力包括低溫、低pH、高滲透壓。

在本發明的一種實施方式中，所述啟動子核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.19任一所示。

在本發明的一種實施方式中，所述啟動子是由大腸桿菌σ因子：σ24|、σ32、σ38、σ70識別的啟動子串聯組合突變得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述啟動子是由大腸桿菌σ因子：σ24|、σ32、σ38、σ70識別的啟動子-35及-10區串聯組合得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述啟動子是由大腸桿菌σ因子：σ24|、σ32、σ38、σ70識別的啟動子對間隔序列兼并突變得到的。

本發明還提供一種構建大腸桿菌強自誘導型啟動子的方法，主要包括以下步驟：

(1)串聯保守序列；將σ²⁴|、σ³²、σ³⁸、σ⁷⁰識別的-35區及-10區人為組合，構建σ^38-70、σ^32-70、σ^24-70、σ^32-38、σ^24-38、σ^32-24、σ^70-24-32、σ^32-38-24、σ^24-38-32-709種啟動子。

(2)兼并突變：對構建的9種啟動子的間隔序列設計兼并引物隨機突變，構建對應的五個啟動子文庫。

(2)高通量篩選：對構建的9種啟動子文庫，以綠色熒光蛋白作為指示蛋白，篩選指標為相對熒光強度，篩選壓力響應型啟動子。

本發明還提供攜帶所述啟動子的載體，可以是pColaDuet-1、pRSFDuet-1、pACYCdUET-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pET28a、pET20b、pET32a、pET22b、pUC18等載體。

有益效果：本發明所獲得的啟動子在不同的壓力(如低pH、高鹽、低溫)環境條件下，均能高效的啟動GFP的表達。

附圖說明