[發明專利]基于轉錄激活因子樣效應物核酸酶的大腸桿菌O157:H7檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201810736905.3
• 申請日: 2018-07-06
• 公開（公告）號: CN108949914B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 白家磊;寧保安;彭媛;王江;李雙;高志賢;王瑜
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

1.一種非診斷目的的基于轉錄激活因子樣效應物核酸酶的大腸桿菌O157:H7檢測方法，其特征在于，該方法包括：

（1）獲取特異識別大腸桿菌O157:H7的16S rDNA的轉錄激活因子樣效應物核酸酶，所述轉錄激活因子樣效應物核酸酶特異識別大腸桿菌O157:H7的16S rDNA中18bp長的一段序列，該序列一條鏈具有如下堿基序列：

5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；

（2）獲取“擬人”分子信標，所述“擬人”分子信標合成過程包括：將發夾、左臂、右臂、左腿、右腿、雙蒸水充分混合，然后高溫變性，逐漸降到室溫；

發夾：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCC CTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；

其中，5’端第18位T堿基上和3’端第18位T堿基上分別連接有熒光基團和與其相應的猝滅基團；

左臂：

5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’；

右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’；

左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’；

右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；

（3）對大腸桿菌O157:H7的16S rDNA進行RPA等溫擴增，獲得目標序列；所述等溫擴增的引物為：

5’-GCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAG-3’，和

5’-CCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTA-3’

（4）將目標序列、分子信標、轉錄激活因子樣效應物核酸酶混合，震蕩反應；測定震蕩反應產物的熒光值；

（5）按照上述方法檢測一系列不同濃度的大腸桿菌O157:H7，建立大腸桿菌O157:H7濃度與熒光值的標準曲線；

（6）按照上述方法檢測未知濃度的含大腸桿菌O157:H7樣品，測定熒光值，代入步驟（5）的標準曲線，計算出樣品中大腸桿菌O157:H7的濃度。

2.根據權利要求1所述的基于轉錄激活因子樣效應物核酸酶的大腸桿菌O157:H7檢測方法，其中，所述高溫變性的條件包括：在95℃保持2-5min。

3.根據權利要求1所述的基于轉錄激活因子樣效應物核酸酶的大腸桿菌O157:H7檢測方法，其中，所述發夾、左臂、右臂、左腿、右腿的濃度均為5-20 μM。

4.根據權利要求1所述的基于轉錄激活因子樣效應物核酸酶的大腸桿菌O157:H7檢測方法，其中，所述熒光基團為FAM；所述猝滅基團為BHQ-1。

5.根據權利要求1所述的基于轉錄激活因子樣效應物核酸酶的大腸桿菌O157:H7檢測方法，其中，一系列不同濃度的大腸桿菌O157:H7的濃度范圍為3 cfu/mL~1×10⁷ cfu/mL。