[發(fā)明專利]一種高酶活淀粉酶的表達(dá)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810735301.7
• 申請(qǐng)日: 2018-07-05
• 公開（公告）號(hào): CN108795903B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金鋒杰;張智敏;莊淼;王寶騰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/26
• 分類號(hào): C12N9/26;C12N1/15;C12N15/56;C12N15/80;C12R1/69
• 代理公司: 南京申云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發(fā)明公開了一種高酶活淀粉酶的表達(dá)方法，先敲除米曲霉中的AO090701000363基因，然后利用該菌株進(jìn)行淀粉酶的表達(dá)，獲得高酶活淀粉酶。本發(fā)明通過同源重組將米曲霉中的AO090701000363基因用選擇標(biāo)記基因pyrG代替，從而獲得AO090701000363敲除菌株，然后利用該菌株進(jìn)行淀粉酶的表達(dá)，可以獲得高酶活淀粉酶，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：AO090701000363的缺失顯著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第3天，AO090701000363敲除菌株的淀粉酶活性是參照菌株的1.5倍左右，后續(xù)兩天缺陷株的活性是參照菌株的2倍之多。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高酶活淀粉酶的表達(dá)方法。

背景技術(shù)

淀粉酶是酶制劑中用途最廣、消費(fèi)量最大的一種。主要用于面包生產(chǎn)中的面團(tuán)改良(降低面團(tuán)粘度、加速發(fā)酵進(jìn)程、增加糖含量、緩和面包老化)；嬰幼兒食品中谷類原料的預(yù)處理；啤酒制造；工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生物制劑等多種領(lǐng)域。米曲霉被美國(guó)FDA及世界衛(wèi)生組織列為食品級(jí)安全菌株(GRAS)，是工業(yè)上淀粉酶的重要來源。通過基因敲除手段選育出更高酶產(chǎn)量的米曲霉，有助于米曲霉在工業(yè)上更好的應(yīng)用。

淀粉是自然界最豐富的原料之一，是人類食物的重要成分，淀粉很容易從植物中獲得，價(jià)格低廉。淀粉利用的關(guān)鍵是通過淀粉酶降解為可發(fā)酵的葡萄糖等可發(fā)酵性糖。根據(jù)作用的方式可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽、山萮菜)及微生物中。

米曲霉應(yīng)用歷史悠久，隨著人類發(fā)展生活所需，獲得高產(chǎn)淀粉酶的菌株，降低淀粉酶的生產(chǎn)成本成為淀粉酶工業(yè)化利用的必由之路，選育優(yōu)良的菌株是酶制劑產(chǎn)業(yè)的核心問題。米曲霉相對(duì)于植物和哺乳動(dòng)物具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌、合成能力以及快速生長(zhǎng)，易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，與大腸桿菌和酵母相比也具有強(qiáng)大的翻譯后修飾功能，被認(rèn)為是生產(chǎn)淀粉酶最有應(yīng)用前景的菌株之一。目前獲得優(yōu)良的高產(chǎn)量菌株，通常采用誘變和基因工程構(gòu)建基因工程菌株等方法。誘變方法簡(jiǎn)單成本低，但是具有一定的隨機(jī)性，因此基因工程技術(shù)手段是未來選育高產(chǎn)量菌株的一個(gè)有效方法，特別的米曲霉的全基因組的破譯更促進(jìn)了基因工程技術(shù)的應(yīng)用。發(fā)展安全、通用、高效、規(guī)模化表達(dá)系統(tǒng)，是全面提高酶制劑產(chǎn)業(yè)技術(shù)水平的戰(zhàn)略必爭(zhēng)之地，對(duì)于酶制劑產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)變革性突破具有十分重要的意義。

米曲霉中淀粉酶轉(zhuǎn)錄激活因子AmyR在淀粉或麥芽糖的誘導(dǎo)下會(huì)激活下游淀粉酶的表達(dá)，而CreA和CreB參與調(diào)控淀粉酶轉(zhuǎn)錄因子AmyR的表達(dá)。米曲霉淀粉酶生產(chǎn)的瓶頸在于：在米曲霉培養(yǎng)后期存在著反抑制調(diào)控，其會(huì)抑制米曲霉淀粉酶的生產(chǎn)，雖然這方面有研究通過刪除單creA和雙creA/creB基因片段，一定程度上提高了在高濃度培養(yǎng)后期的淀粉酶活性，但效果不是很明顯。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高酶活淀粉酶的表達(dá)方法，通過同源重組將米曲霉中的AO090701000363基因用選擇標(biāo)記基因pyrG代替，從而獲得AO090701000363敲除菌株，然后利用該菌株進(jìn)行淀粉酶的表達(dá)，可以獲得高酶活淀粉酶。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種高酶活淀粉酶的表達(dá)方法，先敲除米曲霉中的AO090701000363基因，然后利用該菌株進(jìn)行淀粉酶的表達(dá)，獲得高酶活淀粉酶。

所述的高酶活淀粉酶的表達(dá)方法，通過同源重組將米曲霉中的AO090701000363基因用選擇標(biāo)記基因pyrG代替，從而實(shí)現(xiàn)AO090701000363敲除。

所述的高酶活淀粉酶的表達(dá)方法，具體步驟如下：

1)利用PrimeStar PCR聚合酶擴(kuò)增并獲得AO090701000363基因兩側(cè)片段和pyrG基因；

2)將AO090701000363基因兩側(cè)片段與pyrG基因融合；