[發(fā)明專利]一種安全高效的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810733106.0
• 申請(qǐng)日: 2018-07-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108795902A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜舒;紀(jì)惜鑾;張蕓;郭明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳三智醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/10;C12N15/113
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)脫靶效應(yīng)的技術(shù)缺陷，對(duì)Cas9蛋白的DNA序列結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行了氨基酸位點(diǎn)定點(diǎn)突變，獲得了脫靶效率低的Cas9蛋白，從而實(shí)現(xiàn)靶向性更好更高效的基因編輯功能。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種采用此基因編輯方法進(jìn)行HEK293T細(xì)胞基因編輯的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種安全高效的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

背景技術(shù)

規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇/CRISPR相關(guān)基因(Clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated genes,CRISPR/Cas)系統(tǒng)是細(xì)菌對(duì)噬菌體的長(zhǎng)期抗?fàn)庍^(guò)程中進(jìn)化產(chǎn)生的一種獲得性免疫防御系統(tǒng)，普遍存在于細(xì)菌與古生菌中。

CRISPR是一類獨(dú)特的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，CRISPR基因座由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個(gè)間隔序列區(qū)(Spacer)組成。Cas基因一般位于CRISPR基因座附近。根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9蛋白來(lái)切割DNA雙鏈。Ⅱ型系統(tǒng)是目前被改造得最為成功的人工核酸酶，其CRISPR/Cas基因座結(jié)構(gòu)包括5'端的tracrRNA(trans-activating crRNA)基因，tracrRNA主要與CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(CRISPR-derived RNA，crRNA)形成crRNA：tracrRNA復(fù)合體，幫助Cas9蛋白識(shí)別并與crRNA：tracrRNA復(fù)合體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)特異性識(shí)別；中間是一系列Cas蛋白編碼基因(包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2)，主要發(fā)揮核酸酶切割作用；3'端是CRISPR基因座。

目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已作為一種基因組編輯技術(shù)被廣泛地研究和利用，該技術(shù)利用人工設(shè)計(jì)的向?qū)NA(single-guide RNA,sgRNA)介導(dǎo)外源表達(dá)的Cas9蛋白與基因組靶點(diǎn)特異性結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA的特異性切割，切割后的基因組DNA通過(guò)非同源末端連接或同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除、敲入等。相比傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)如鋅指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN)，CRISPR/Cas系統(tǒng)技術(shù)具有技術(shù)流程簡(jiǎn)易、基因編輯效率高、特異性更強(qiáng)、應(yīng)用范圍更廣的優(yōu)勢(shì)。

然而，作為基因編輯技術(shù)，脫靶效應(yīng)是不可避免的一個(gè)缺點(diǎn)，影響了其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的進(jìn)程。因此，如何在提高CRISPR/Cas技術(shù)基因編輯效率的同時(shí)提高其靶向性，是該技術(shù)目前面臨的一大難題。

發(fā)明內(nèi)容

為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明對(duì)pSpCas9載體進(jìn)行了修飾，提高其靶向性。

本發(fā)明針對(duì)已發(fā)表文獻(xiàn)中的Cas9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)中DNA序列結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸突變，獲得了脫靶效率低的Cas9蛋白，其序列見(jiàn)序列表中序號(hào)1的Cas9蛋白序列，晶體形態(tài)見(jiàn)圖1，其中突變位點(diǎn)有：848號(hào)氨基酸位點(diǎn)堿基序列為GCG，對(duì)應(yīng)的氨基酸為丙氨酸；1003號(hào)氨基酸位點(diǎn)堿基序列為GCG，對(duì)應(yīng)的氨基酸為丙氨酸；1060號(hào)氨基酸位點(diǎn)堿基序列為GCG，對(duì)應(yīng)的氨基酸為丙氨酸。新得到的SpCas9我們命名為SpCas9-SZ。

相比現(xiàn)有的CRISPR-Cas9系統(tǒng)技術(shù)，本發(fā)明構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì)：