[發明專利]木槿品種奧蘇藍、弗洛魯、阿登、敏柔莎的分子特異性標記引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201810733014.2
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN108690882B
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 楊少宗;方茹;劉本同;徐梁;林昌禮;程亞平
• 申請（專利權）人: 浙江省林業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 33209 杭州天欣專利事務所(普通合伙)
• 代理人: 張狄峰

1.一種木槿品種奧蘇藍、弗洛魯、阿登、敏柔莎的分子特異性標記引物，其特征在于，所述分子特異性標記引物包括上游引物和下游引物，所述分子特異性標記引物序列如下：

上游引物：5′-AAGATACACTGGAATAGAACA-3′；

下游引物：5′-GAATTCACGCTTCGATGCTCA-3′。

2.一種木槿品種奧蘇藍、弗洛魯、阿登、敏柔莎的檢測方法，其特征在于，利用如權利要求1所述的木槿品種奧蘇藍，弗洛魯，阿登，敏柔莎的分子特異性標記引物，所述檢測方法如下：提取待測木槿品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，對提取的木槿品種葉片的基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果僅出現500bp的DNA條帶，則待測木槿品種為奧蘇藍（Hibiscus syriacus ‘OiseauBleu’）、弗洛魯（Hibiscus syriacus ‘Floru’）、阿登（Hibiscus syriacus ‘Ardens’）或敏柔莎（Hibiscus syriacus ‘Minrosa’），若電泳結果同時出現500bp和190bp的DNA條帶則否。

3.根據權利要求2所述的木槿品種奧蘇藍、弗洛魯、阿登、敏柔莎的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增條件如下：95℃預變性2.5-3.5min；95℃變性35-45s，58℃退火35-45s，72℃延伸0.5-1.5min，共30-40個循環；最后于72℃補平6-8min，終止溫度為3-5℃。

4.根據權利要求3所述的木槿品種奧蘇藍、弗洛魯、阿登、敏柔莎的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增條件如下：95℃預變性3min；95℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，共35個循環；最后于72℃補平7min，終止溫度為4℃。

5.根據權利要求3所述的木槿品種奧蘇藍、弗洛魯、阿登、敏柔莎的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法步驟如下：

第一步：取待測木槿葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測木槿葉片的基因組DNA；

第二步：以第一步提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增：

PCR擴增體系每25μL中各組分如下：

10×PCRBuffer：2.5μL；

10mmol/LdNTPs：2.5μL；

25mmol/LMgCl₂：2.5μL；

5U/μLTaqDNA酶：0.2μL；

10μM上游引物：1μL；

10μM下游引物：1μL；

20ng/μL模板DNA：3μL；

ddH₂O補足至25μL；

第三步：取第二步的擴增產物5μL，與1μL0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1×TAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠圖像分析儀上進行拍攝，若電泳結果僅出現500bp的DNA條帶，則待測木槿品種為奧蘇藍、弗洛魯、阿登或敏柔莎，若電泳結果同時出現500bp和190bp的DNA條帶則否。