[發明專利]基于進化信息構建嵌合SaCas9用于增強和擴展PAM位點的識別

有效

• 申請號: 201810731984.9
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN110684755B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 謝震;馬大程;張昭煜;許志錳
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.一種Cas9蛋白突變體，其特征在于，其具有：

框架區；和

PAM識別區，所述PAM識別區識別下列核酸序列的至少之一：

5’-NNNRRT-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNRRN-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNRCN-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNRTN-3’，N＝A、T、G或C、R＝A或G；

5’-NNNCAA-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNCAT-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNCGT-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNCGC-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNGTN-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTCN-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTTC-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTTG-3’，N＝A、T、G或C；

5’-NNNTTT-3’，N＝A、T、G或C，

其中，相對于saCas9，所述PAM識別區與982IGVNNDLLNRIEV 994相比具有下列突變的至少之一：

第982位突變為T、K、R或L，

第983位突變為A、C或S，

第984位突變為T、D，

第985位突變為F、S、A、N，

第986位突變為E、D、H、A、M，

第987位突變為S、G、N、S、D、E、P，

第988位突變為D、K、T、S、T、D、K、R、E、A，

第989位突變為R、A、N、Q、G、E、T、K、S、G、H、V，

第990位突變為S，

第991位突變為I、V、L、K、T、M，

第992位突變為V、L，

第993位突變為Q，

第994位突變為L、M、C、I、A；

其中，所述PAM識別區的氨基酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:43所示；所述框架區的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～2、130所示；所述Cas9蛋白突變體的氨基酸序列如SEQ IDNO:44～84、131所示。

2.一種核酸，其特征在于，所述核酸編碼權利要求1所述的Cas9蛋白突變體。

3.根據權利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO:85～125、132任一所述的核苷酸序列。

4.一種試劑盒，其特征在于，包括：

第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼權利要求1所述的Cas9蛋白突變體；以及

第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼gRNA。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO:85～125、132任一所述的核苷酸序列。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述第二核酸分子是SEQ ID NO:127～129任一所述的核苷酸序列。

7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述第一核酸分子、第二核酸分子負載在同一表達載體上。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述同一表達載體為腺病毒載體。

9.一種對細胞進行基因改造的方法，其特征在于，將第一核酸分子和第二核酸分子引入待改造的細胞中，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子是如權利要求4～8任一項所述的，所述方法用于非疾病診斷或治療目的。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白突變體的PAM識別區序列和所述gRNA序列是基于待改造的基因序列確定的。