[發明專利]一種轉化菰cDNA文庫改良水稻品種的方法

在審

• 申請號: 201810731902.0
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN108795976A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 喬保建;喬琪;夏祥華;任代勝;付錫江;陶元平;彭沖
• 申請（專利權）人: 安徽袁糧水稻產業有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46;C40B50/06
• 代理公司: 蕪湖思誠知識產權代理有限公司 34138
• 代理人: 楊濤

本發明公開了一種轉化菰cDNA文庫改良水稻品種的方法，涉及分子生物學領域。本發明通過構建菰的cDNA文庫，并通過農桿菌介導轉化進入水稻基因組中，高通量改良水稻品種，在獲得的轉基因系中篩選具有優良基因特性的個體，轉基因系與野生型相比，在株高，分蘗、抽穗期、葉形、葉色方面均呈現出明顯的變化，考種分析顯示23個水稻轉基因系與產量提升相關。本發明具有時間短、效率高、水稻突變性狀豐富。對出現變化的水稻植株進行轉基因驗證分析，遺傳背景明確，篩選可利用的優良基因用于后續水稻靶向改良。

技術領域

本發明涉及分子生物學域，特別涉及一種轉化菰cDNA文庫改良水稻品種的方法。

背景技術

水稻產量關乎世界糧食安全，一直以來都是農業科技工作者關注的焦點和熱點。我們目前可以通過各種手段來提高水稻產量，比如施肥打藥、科學種田、合理灌溉、發展雜交稻、發展再生稻、三季稻種植、通過轉基因技術改良水稻等。隨著社會的進步，在我們要建設環境友好型社會和要求食品安全的情況下，大力改良水稻，節約化肥少打藥是一個共識，而這里就有兩點值得關注，一是發展雜交稻，例如紅蓮型雜交稻“路優8號”和“洛優10號’，具有高產、優質、廣適、節省農藥化肥；二是發掘優質基因轉化水稻提高水稻產量和抗逆抗病蟲害能力，如顯著提高水稻產量的玉米基因shrunken-2(Sh2)，Bph14/I S抗褐飛虱基因等。

研究發現農桿菌侵染的宿主多，農桿菌轉基因先在雙子葉植物(如擬南芥和煙草等)中得到了應用，后來在單子葉植物(水稻、玉米、高粱、小麥等)里也得到應用。農桿菌轉基因技術的高效和其具有的獨特優勢，使得多個大型突變體庫被構建成功；研究人員可以采用一些方法如接頭PCR、環化PCR,TaiL-PCR等鑒定插入位點的側翼序列，而有的側翼序列信息己經被提交在網站上供有需要的其他科研工作者參考和分析，好處就是省去了我們費時費力的圖位克隆工作。

農桿菌介導的轉基因技術的優點。1、由于插入的T-DNA序列是己知的，這就可以從正向遺傳學方法研究基因和表型的關系，而且克隆基因相對簡單些；2、農桿菌轉基因雖然會插入多個拷貝，但是相對來說還是很低的，有利于得到純合的能穩定遺傳的單株，符合孟德爾遺傳分離定律等；3、目前的研究表明T-DNA插入有偏好性，但是也有隨機性，并在大型突變體庫的構建中得到了應用。

菰是國家二級保護植物品種，也是水稻的近緣屬，具有生物量大、抗病從，耐寒等許多優良性狀，近年來被眾多研究學者作為水稻育種優良基因資源庫的重要來源。然而，針對菰的分子生物學研究仍處于起步階段，菰的遺傳信息獲得還很不完善，對菰基因信息的有限所知嚴重阻礙了其作為水稻育種優良基因資源庫的研究與應用，因此開發一種高效利用菰的優良基因資源庫進行水稻品種改良的方法十分重要。

目前，水稻育種分為傳統雜交育種和基因重組育種，傳統雜交育種具有遺傳背景單一，篩選周期長的缺點，無法高效富集優良基因，基因重組育種又受限于對單一基因的測序、定位和克隆，無法高通量篩選優良的轉基因水稻品種。因此，開發一種快速，簡單、高效的高通量轉化菰的cDNA文庫改良水稻品種的方法十分必要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題：針對目前對菰遺傳資源利用和水稻育種中存在的問題，本發明公開了一種快速，簡單、高效的高通量轉化菰的cDNA文庫改良水稻品種的方法。

為解決上述技術問題，本發明提供以下的技術方案：

一種轉化菰cDNA文庫改良水稻品種的方法，包含以下操作步驟：

(1)菰cDNA文庫的構建；

(2)E.coli菰cDNA文庫大規模質粒抽提；

(3)菰目的cDNA過表達文庫質粒電轉化農桿菌，方法如下：

(A)首先從-70℃取出6支農桿菌感受態放置于冰上融解；

(B)電轉前加入2μL質粒DNA于100μL感受態細胞中，用槍頭輕輕吹打混勻；