[發(fā)明專利]一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810729443.2
• 申請(qǐng)日: 2018-07-04
• 公開（公告）號(hào): CN108949815A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 米鐵柱;張國(guó)棟;劉佳音;張志勇;羅碧;修旺珊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島袁策集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/65;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京華仁聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11588
• 代理人: 李冰

1.一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、MRFP1基因表達(dá)盒的獲得；

B、小麥花粉致死基因Ki的擴(kuò)增；

C、水稻PTC1盒的獲得；

D、小麥花粉特異性啟動(dòng)子Pg47的擴(kuò)增；

E、各基因表達(dá)元件的連接。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步驟C、水稻PTC1盒的獲得，進(jìn)一步包括：

提取水稻植株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，以F3/R3為上下游引物進(jìn)行完整PTC1基因表達(dá)盒的擴(kuò)增，擴(kuò)增過(guò)程中分別在上游引物和下游引物中引入SmaI和AaaI酶切位點(diǎn)，其擴(kuò)增的水稻PTC1基因包含其上游的啟動(dòng)子和下游的終止子，同時(shí)包含所有的外顯子和內(nèi)含子。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步驟A、MRFP1基因表達(dá)盒的獲得，進(jìn)一步包括：

以含有MRFP1基因完整表達(dá)盒的質(zhì)粒為模板，以F1/R1為上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增過(guò)程中分別在上下游引物中引入EcoRI和KpnI位點(diǎn)，同時(shí)在下游引物引入的KpnI位點(diǎn)前面加入DraI酶切位點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步驟B、小麥花粉致死基因Ki的擴(kuò)增，進(jìn)一步包括：

以小麥基因組DNA為模板，以F2/R2為上下游引物進(jìn)行小麥花粉致死基因Ki的擴(kuò)增，在上下游引物中引入DraI酶切位點(diǎn)；其擴(kuò)增的致死基因Ki包含所有的外顯子和內(nèi)含子。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步驟D、小麥花粉特異性啟動(dòng)子Pg47的擴(kuò)增，進(jìn)一步包括：

以小麥基因組DNA為模板，以F4/R4為上下游引物進(jìn)行花粉特異性啟動(dòng)Pg47擴(kuò)增，在上下游引物中分別引入Kpn I和Sma I酶切位點(diǎn)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步驟E、各基因表達(dá)元件的連接，進(jìn)一步包括：

第一步，將MRFP1基因表達(dá)元件連接到pCAMBIA1300載體上；

第二步，將完整的水稻PTC1基因引入第一步中已經(jīng)引入MRFP1基因表達(dá)元件的pCAMBIA1390載體上；

第三步，將小麥花粉致死基因Ki連入到已經(jīng)連有MRFP1基因表達(dá)元件和水稻PTC1基因的pCAMBIA1390雙元載體上；

第四步，將花粉特異性啟動(dòng)Pg47連接到前三步已經(jīng)連接上MRFP1基因表達(dá)元件、水稻PTC1基因和小麥花粉致死基因Ki的復(fù)合載體上。

7.一種基于PTC1基因的轉(zhuǎn)基因水稻不育系的培育方法，其特征在于，應(yīng)用水稻PTC1基因表達(dá)盒構(gòu)建如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述方法制備的水稻不育系。

8.一種如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述方法在水稻遺傳育種中的應(yīng)用。