[發明專利]一種基于MSP1基因的轉基因水稻不育系的培育方法

在審

• 申請號: 201810728703.4
• 申請日: 2018-07-04
• 公開（公告）號: CN108841859A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 米鐵柱;張國棟;劉佳音;徐春瑩;葛序娟;王克響
• 申請（專利權）人: 青島袁策集團有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 李冰

本申請公開了一種基于MSP1基因的轉基因水稻不育系的培育方法，包括以下步驟：A、mPlum基因表達盒的獲得；B、水稻MSP1基因表達盒的獲得；C、小麥致死基因Ki的擴增；D、小麥花粉特異性啟動子Pg47的擴增；E、各基因表達元件的連接。所述步驟E、各基因表達元件的連接，進一步包括：第一步，將mPlum基因表達元件連接到pCAMBIA1301載體上；第二步，將完整的水稻MSP1基因引入第一步中已經引入mPlum基因表達元件的pCAMBIA1301載體上。本發明F1代雜合體在自交結實過程中遵循孟德爾分離定律，產生的后代既有能保持三連鎖基因的雜合體，又有無育性的不育系。

技術領域

本發明涉及分子生物學核酸化學技術領域，特別涉及一種水稻遺傳工程不育系的制備方法。

背景技術

水稻是是世界上近一半的人口的主食，除可食用外，還可以釀酒、制糖和作為工業原料，人類對水稻的需求很大。多年來的生產實踐表明，雜交水稻一般可比常規稻增產20％以上，因此雜交水稻彰顯著巨大的增產潛力。

雜交水稻的發展依賴于雜交水稻不育系的培育。我國雜交水稻的研究始于上個世紀60年代，70年代開始大規模被種植。第一代雜交水稻是以核質互作雄性不育系為遺傳工具的三系法，第二代雜交水稻是以光溫敏雄性不育系為遺傳工具的兩系法，“三系法”和“兩系法”雜交育種技術對糧食增產貢獻巨大，但也存在問題。三系法中可利用的具有優良形狀的父母本有限，配組不自由，野敗保持系頻率較低。

生產上現有的不育系間遺傳差異小，雜交種育性穩定性不夠，抵御逆境能力較差。而“兩系法”中光溫敏雄性不育系的育性受外界溫度控制，易導致光溫敏不育系自交結實，制種失敗。因此開發新一代不育系對雜交水稻的發展至關重要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于，提供了一種基于MSP1基因的轉基因水稻不育系的培育方法。本發明將水稻普通核不育基因MSP1與小麥種的致死基因ki連鎖，同時以遠紅外熒光蛋白mPlum基因作為報告基因，對水稻MSP1突變體進行基因改造，獲得F1代雜合體。F1代雜合體在自交結實過程中遵循孟德爾分離定律，產生的后代既有能保持三連鎖基因的雜合體，又有無育性的不育系。

為解決上述技術問題，本發明提供了一種基于MSP1基因的轉基因水稻不育系的培育方法，包括以下步驟：

A、mPlum基因表達盒的獲得；

B、小麥致死基因Ki的擴增；

C、水稻MSP1盒的獲得：

D、小麥花粉特異性啟動子Pg47的擴增；

E、各基因表達元件的連接。

所述步驟C、水稻MSP1盒的獲得，進一步的包括：

提取水稻植株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，以F3/R3為上下游引物進行完整MSP1基因表達盒的擴增，擴增過程中分別在上游引物和下游引物中引入Sma I和Sal I酶切位點，其擴增的水稻MSP1基因包含其上游的啟動子和下游的終止子，同時包含所有的外顯子和內含子。

所述步驟A、mPlum基因表達盒的獲得，進一步包括：

以含有mPlum基因完整表達盒的質粒為模板，以F1/R1為上下游引物進行擴增，擴增過程中分別在上下游引物中引入AcsI和Kpn I位點，同時在下游引物引入的KpnI位點前面加入Msel酶切位點。

所述步驟B、小麥致死基因Ki的擴增，進一步包括：

以小麥基因組DNA為模板，以F2/R2為上下游引物進行小麥致死基因Ki的擴增，在上下游引物中引入Msel酶切位點；其擴增的致死基因Ki包含所有的外顯子和內含子。

所述步驟D、小麥花粉特異性啟動子Pg47的擴增，進一步包括：