[發明專利]一種基于單克隆抗體檢測人proGRP的雙夾心ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201810727981.8
• 申請日: 2018-07-05
• 公開（公告）號: CN108982858B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 夏海濱;王玉芬
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種基于單克隆抗體檢測人proGRP的雙夾心ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒的內容物組成如下：

96孔ELISA酶標板；

包被抗體，該包被抗體是由針對人proGRP中30-41aa結構域的小鼠抗人單克隆抗體EP1-1以及針對人proGRP中69-80aa結構域的小鼠抗人單克隆抗體EP2-3和EP2-4組成的混合物，混合比例為2：1：1，工作總濃度為20μg/mL；

人proGRP標準蛋白，該人proGRP標準蛋白通過真核蛋白純化的方法獲得；

生物素標記的檢測抗體，該生物素標記的EP3-1-biotin，是針對人proGRP中83-94aa結構域的小鼠抗人單克隆抗體，工作濃度為5μg/mL；

Avidin與HRP的交聯蛋白、包被緩沖液、封閉液、樣品及檢測抗體稀釋液、ELISA酶標板洗滌液、底物液和終止液；其中：

所述的包被緩沖液為0.05M的碳酸鹽緩沖液，pH為9.6；

所述封閉液為含體積分數為10％小牛血清的磷酸鹽緩沖液，pH為7.4；

所述樣品及檢測抗體稀釋液為含體積分數為1％小牛血清的磷酸鹽緩沖液，pH為7.4；

所述ELISA酶標板洗滌液為含體積分數為0.10％Tween-20的磷酸鹽緩沖液，pH為7.4；

所述底物液為TMB；

所述終止液為摩爾濃度為2M的濃硫酸溶液；

所述的Avidin與HRP的交聯蛋白是采用過碘酸鈉法獲得。

2.如權利要求1所述的基于單克隆抗體檢測人proGRP的雙夾心ELISA試劑盒，其特征在于，所述的過碘酸鈉方法是將HRP與過碘酸鈉反應，獲得活化的HRP，然后Avidin與活化的HRP反應，得到Avidin與HRP的交聯蛋白。

3.權利要求1或2所述的基于單克隆抗體檢測人proGRP的雙夾心ELISA試劑盒的構建方法，其特征在于，運用蛋白質三維結構預測軟件預測proGRP的線性表位EP1：30-41aa；EP2：69-80aa；EP3：83-94aa，用偶聯多肽的方法進行小鼠免疫；所述多肽偶聯方法其一是通過原核表達融合HBV-C/表位小肽蛋白增強小肽的免疫原性；其二是通過使用表位小肽修飾Ad5腺病毒E1區與Hexon區增強其免疫原性；其三是通過融合蛋白與修飾腺病毒交叉免疫小鼠，產生針對特定抗原表位的抗體。

4.權利要求1或2所述的基于單克隆抗體檢測人proGRP的雙夾心ELISA試劑盒用于制備小細胞肺癌病人的血清學檢測試劑盒的應用，所述小細胞肺癌病人的血清學檢測是檢測重組的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白；

檢測重組的proGRP蛋白以及天然的人proGRP蛋白具體步驟包括：

(1)包被ELISA酶標板：用包被緩沖液將包被抗體EP1-1、EP2-3和EP2-4按比例稀釋成20μg/mL，100μL/孔，4℃過夜；

(2)封閉：甩去孔中液體，加入200μL/孔的ELISA酶標板洗滌液，洗滌3-5次后，加入200μL/孔的封閉液，37℃、2h后，洗滌3-5次，并甩干；

(3)加待檢測樣品：向所述酶標板中加入待檢測樣品，100μL/孔，37℃、1h后，洗滌3-5次，并甩干；

(4)加檢測抗體：向所述酶標板中加入檢測抗體EP3-1-biotin，100μL/孔，37℃、1h后，洗滌3-5次，并甩干；

(5)加Avidin與HRP的交聯蛋白：向所述酶標板中加入Avidin與HRP的交聯蛋白，100μL/孔，37℃、1h后，洗滌5-6次，并甩干；

(6)化學發光：向所述酶標板中加入顯色液，100μL/孔；

(7)顯色：加入顯色液后，37℃避光顯色5分鐘，置于酶標儀中檢測450nm吸光值。