[發(fā)明專利]一套基于CRISPR/Cas9的腫瘤標志分子核酸適配體及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810717217.2
• 申請日: 2018-07-03
• 公開（公告）號: CN109576273A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙永祥;張志勇;薛志剛;周素芳;張坤
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/574
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 韋肖燕

本發(fā)明公開一套基于CRISPR/Cas9的腫瘤標志分子核酸適配體及應(yīng)用，屬于基因工程、免疫學和腫瘤學技術(shù)領(lǐng)域。所述的適配體為SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一條或幾條序列。本發(fā)明核酸適配體利用全細胞消減Cell?SELEX技術(shù)篩選而得，分子量較小，易于合成與修飾，能夠高特異性識別并且高親和力結(jié)合ATG16L1、CSNK2、PPP1等腫瘤標志物分子，與其它細胞不發(fā)生特性結(jié)合，無免疫原性，穩(wěn)定易修飾，便于合成和保存。用所述適配體制備的腫瘤標志分子檢測試劑盒和試劑紙對腫瘤標志分子檢測靈敏度高，且易于優(yōu)化。在腫瘤診斷、腫瘤預后與監(jiān)測的評估，腫瘤診斷中應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程、免疫學和腫瘤學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一套基于CRISPR/Cas9的腫瘤標志分子核酸適配體及應(yīng)用。

背景技術(shù)

從酵母菌到哺乳動物的研究中均證實自噬系統(tǒng)受到一些進化的自噬相關(guān)蛋白（ATG）的嚴格調(diào)控。自噬始于BECN1 / Beclin 1與III類磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3C3），它有助于吞噬泡吸收其他ATG蛋白形成細胞核。在擴增時，細胞質(zhì)內(nèi)容物被雙膜吞噬泡直接吸收，然后生成完整的自噬體；自噬體與溶酶體融合降解其它物質(zhì)。自噬體成熟需要一系列的泛素樣共軛事件，主要涉及LC3-磷脂酰乙醇胺（PE）和ATG12-ATG5-ATG16L1共軛體系。這些核心ATG蛋白，包括ATG16L1，都是自噬體不可或缺的。ATG16L1與ATG12-ATG5交互共軛形成二聚體復合物，其靶向吞噬細胞并通過充當一種脂質(zhì)E3類泛素連接酶促進MAP1LC3B /LC3B（微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈3 b）酯化，雖然ATG16L1在自噬過程中的功能過程有據(jù)可查，但對ATG16L1活性的調(diào)控機制知之甚少。

CSNK2是一個高度保守的，組成性的，廣泛表達的絲氨酸-蘇氨酸激酶，是一個包含2個催化亞基的四聚體全酶（CSNK2A1 / a和/或CSNK2A2 / a'）和2個監(jiān)管亞基（CSNK2B /b）的復合物。該酶承擔超過300個底物的磷酸化并影響一系列的生物過程，包括染色體分離，紡錘體形成，調(diào)節(jié)細胞凋亡，控制細胞增殖，和晝夜節(jié)律。最近的研究也表明aPPP1在自噬調(diào)控中發(fā)揮潛在的作用。

蛋白磷酸化可以被磷酸酶等逆轉(zhuǎn)，例如PPP1，一種普遍表達的真核絲氨酸/蘇氨酸，是能影響多種細胞功能和過程的蛋白磷酸酶。PPP1歸屬的蛋白磷酸酶家族包括4個主要亞科：PPP1，PPP2CA，PPP2CB和PPP5。有趣的是，像CSNK2一樣，PPP2（蛋白磷酸酶2）促進親自噬BECN1活性通過誘導構(gòu)象變化BECN1在Ras-NIH 3T3細胞中。

核酸適配體是一類能與靶分子高特異性高親和力結(jié)合的DNA或RNA序列，具有與抗體類似的作用，常常被稱為“化學抗體”。近年來，隨著核酸適配體篩選技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的腫瘤相關(guān)核酸適配體序列被人們所發(fā)現(xiàn)。然而，這些腫瘤相關(guān)的核酸適配體常常僅能識別一種腫瘤細胞或一種腫瘤，很大程度限制了核酸適配體的應(yīng)用。

CRISPR/Cas9技術(shù)作為近幾年的熱門技術(shù)，是眾多學者研究和應(yīng)用的對象，CRISPR/Cas9技術(shù)對靶細胞目的基因進行靶向敲除（Knock out）或敲入（Knock in）多是用于基因治療，運用此方式構(gòu)建細胞模型進行進一步生物學研究還有待開發(fā)。目前，Cell-SELEX進行核酸適配體篩選多是針對不同種類的未知靶點的腫瘤細胞進行。但不同腫瘤細胞之間具有差異性，缺乏共同的靶標分子。因此，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達目的基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，減少細胞模型的構(gòu)建時間，降低模型的構(gòu)建成本，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分子量較小，易于合成與修飾，提出一套基于CRISPR/Cas9的腫瘤標志分子核酸適配體及應(yīng)用。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，使用的技術(shù)方案為：一套基于CRISPR/Cas9的腫瘤標志分子核酸適配體，所述的適配體為SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一條或幾條序列。