[發明專利]基于單粒徑膠乳顆粒的檢測NGAL的免疫膠乳比濁法試劑盒

有效

• 申請號: 201810716106.X
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108872616B
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 柳建敏;林威彥;裘艷群
• 申請（專利權）人: 寧波海壹生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/92
• 分類號: G01N33/92;G01N33/577
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 黃勇

本發明公開了一種基于單粒徑膠乳顆粒的檢測NGAL的免疫膠乳比濁法試劑盒，所述試劑盒包括試劑R1和試劑R2，其中，所述試劑R1包含緩沖液、表面活性劑、促凝劑、螯合劑、防腐劑、還原劑、電解質和水，所述試劑R2包含緩沖液、穩定劑、電解質、包被有抗人NGAL多克隆抗體的膠乳顆粒，其中，所述還原劑為β?巰基乙醇，所述抗人NGAL多克隆抗體是生物素標記的抗人NGAL多克隆抗體，所述膠乳顆粒是鏈霉親和素標記的單粒徑膠乳顆粒。本發明的試劑盒可以同時檢測血液與尿液樣本中的NGAL，不僅具有提高的檢測靈敏度和線性范圍，還可以克服干擾因子的影響，檢測到NGAL同源二聚體和異源二聚體，避免NGAL檢測結果偏低導致醫生的誤判。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于單粒徑膠乳顆粒并可同時檢測血清和尿液中的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒。

背景技術

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)，又稱人脂質運載蛋白2(lipocalin 2，Ln2)或噬鐵蛋白(siderocalin)，是人脂質運載蛋白家族中的一個新成員。近年來，NGAL作為一種新的腎損傷標志物而倍受關注。

NGAL是1993年Kjeldsen等發現的，與明膠酶B即基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)密切相關。人類NGAL基因的全長為25000bp，其蛋白有三種存在形式：分子量為25kDa的單體、自身聚合46kDa同源二聚體或與MMP-9聚合形成135kDa異源二聚體。NGAL可能參與不同的生理、病理過程。NGAL是急性腎損傷的標志物。早期診斷急性腎功能損傷(AKI)時，血、尿中的NGAL濃度通常會迅速升高，2h最為明顯(比臨界值升高幾十至幾百倍)，而血清肌酐(sCr)、尿酶等傳統指標往往要在24～72h才后明顯升高，因而NGAL可用于AKI的早期診斷。同時，NGAL還可以反映腎功能損傷的嚴重程度，因而血和尿中的NGAL可以反映AKI嚴重程度，并且預后NGAL可作為AKI的預后指標之一。

NGAL也是反映腎臟慢性損害的一種有潛力的新標記物，在慢性腎臟病(chronickidney disease，CKD)患者中，NGAL能確切反映腎臟損害的程度，是CKD進展的一個強力和獨立的風險指標。

研究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量檢測結果分布在0.7-9.6ng/ml之間，平均值為5.3ng/ml，而血漿中的含量檢測結果為37-106ng/ml，平均值為63ng/ml。當腎損傷后，NGAL水平將迅速陡增。隨機檢測重病患者，尿液NGAL的濃度為110ng/ml到40000ng/ml不等，而他們的EDTA抗凝血漿檢測結果為25ng/ml到3491ng/ml。當尿液中的NGAL含量超過350ng/ml，或者血漿中的NGAL含量達到400ng/ml以上時發生腎功能衰竭的陽性預測值為90％。

已知測定NGAL的方法有免疫擴散法、免疫電泳法、放射免疫分析法、酶聯免疫法，然而，這些方法存在著操作繁瑣、需要特殊的裝備、樣本需要預處理、不能進行批量樣本分析和不能直接上全自動生化分析儀檢測等缺點。膠乳增強免疫比濁法也是測定人尿液或血漿中NGAL濃度的常用方法，與其他幾種方法相比較，存在操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬、無污染、應用范圍廣等顯著的特點，因此，膠乳免疫比濁法有著極大的研究價值。膠乳增強免疫比濁法(PETIA)的基本原理是：將抗體包被在膠乳顆粒上，與相應抗原發生免疫反應后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物所產生的濁度，即可測出標本中被檢物的含量。

目前市售的各種NGAL膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒存在諸多缺點：用單一粒徑膠乳顆粒和抗體偶聯，往往存在著分析靈敏度低和線性范圍窄的缺點，檢測靈敏度只能到10ng/ml，遠不能檢測正常人的數值；另外，很少有試劑盒能夠避開NGAL同源二聚體和異源二聚體的干擾，從而造成檢測結果假陰性。因此，目前急需一種能夠排除NGAL同源二聚體和異源二聚體的干擾、檢測靈敏度高、檢測線性范圍寬的一種NGAL膠乳增強免疫比濁法檢測試劑盒。