[發明專利]一種豬細小病毒的增殖方法

有效

• 申請號: 201810706790.3
• 申請日: 2018-07-02
• 公開（公告）號: CN108795884B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 吳娟;繆汝娉;鮑大為
• 申請（專利權）人: 蘇州良辰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 汪青;周敏

本發明涉及一種豬細小病毒的增殖方法，將豬細小病毒接種于ST細胞，進行細胞培養至90%~100%細胞出現病變；反復凍融使宿主細胞破碎，離心去除細胞碎片，收集上清液；將上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L?精氨酸混勻，然后進行冷凍干燥；其中，牛血清白蛋白（BSA）占混合液總質量的1~2%，甘露醇和/或甘氨酸占混合液總質量的1~3%，L?精氨酸占混合液總質量的0.5~3%。本發明提供的豬細小病毒的增殖方法，工藝簡便、傳代次數少，在病毒去除/滅活驗證具有廣泛應用前景。增殖后的病毒滴度不低于10^6.0 TCID₅₀/0.1ml，顯著高于現行技術培養的豬細小病毒的滴度。

技術領域

本發明屬于微生物應用領域病毒培養技術，具體涉及一種豬細小病毒的增殖方法。

背景技術

培養基是維持體外細胞生存和生長的基本溶液，合成培養基中一般含有必需氨基酸，這些對細胞生長、病毒增殖都有影響。氨基酸作為一類能夠提高病毒滴度的物質，在相同的培養條件下，添加少量氨基酸即可獲得更高滴度的病毒。

冷凍干燥或“凍干”是用于去除水分的技術方法。其中，含水溶液在其共晶點以下被冷卻，直至其完全被冷凍。之后，將大氣壓降至真空，使得水升華并從溶液中脫出。被溶解的因子保持為多孔固體，之后其可再次溶于水。因此冷凍干燥也可以作為濃縮的一種手段。

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)屬于細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒屬(Parvovirus)，是引起母豬繁殖障礙疾病的主要病原之一，可導致母豬流產、早產、產死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡。PPV對熱具有較強抵抗力，56℃48小時、70℃2小時病毒的感染性和血凝性均無明顯改變；對酸堿有較強的抵抗力，在pH3.0～9.0之間穩定；能抵抗乙醚、氯仿等脂溶劑；甲醛蒸氣和紫外線需要相當長的時間才能殺死該病毒。

PPV作為一類無包膜、單股DNA基因組和強抵抗力的病毒，在血液制品、生物制品和動物源性醫療器械的病毒去除/滅活驗證中，具有廣泛的應用。

在病毒去除/滅活驗證中，指示病毒的滴度需達到10⁶TCID₅₀以上，但豬細小病毒在不同的細胞上增殖效果不盡相同，出現病變的時間、病變特征、病變觀察的難易程度、病毒含量和血凝價均有所差別，如不能掌握其規律選擇最佳的細胞系進行病毒的培養及培養技術，將很難培養出高的的滴度。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種豬細小病毒的增殖方法，培養出的病毒滴度高。

為解決以上技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種豬細小病毒的增殖方法，包括如下步驟：

(1)將豬細小病毒接種于ST細胞，進行細胞培養至90％～100％細胞出現病變；

(2)反復凍融使宿主細胞破碎，離心去除細胞碎片，收集上清液；

(3)將所述的上清液、牛血清白蛋白、甘露醇和/或甘氨酸、L-精氨酸混勻得到混合液，然后將所述的混合液進行冷凍干燥；其中，所述的牛血清白蛋白(BSA)占所述的混合液總質量的1～2％，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液總質量的1～3％，所述的L-精氨酸占所述的混合液總質量的0.5～3％。

優選地，所述的牛血清白蛋白占所述的混合液總質量的1.5～2％。

優選地，所述的甘露醇和/或甘氨酸占所述的混合液總質量的2.5～3％。

優選地，所述的L-精氨酸占所述的混合液總質量的2.5～3％。

優選地，所述的增殖方法還包括將冷凍干燥后的病毒用含1～3wt％胎牛血清的MEM培養基復溶至所述的上清液體積的5～15％的步驟。