[發明專利]一種粒系白血病融合基因檢測質控參考株的制備

在審

• 申請號: 201810703505.2
• 申請日: 2018-06-15
• 公開（公告）號: CN108998426A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 翁炳煥;蘇嵐;楊艷梅;杜雨軒;王薇;應俊
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N5/28
• 分類號: C12N5/28;C12N15/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種用于醫學領域的粒系白血病融合基因檢測質控參考株的制備，其特征在于，引用了重組人粒細胞集落刺激因子，增加了以粒細胞集落刺激因子為誘導劑的骨髓細胞融合前培養步驟，以促使粒系各期細胞的定向分化、增量和成熟，從而增加粒系的融合率，而且粒細胞集落刺激因子參與了骨髓細胞融合、雜交細胞篩選及其克隆化傳代擴增的全程誘導，有利于粒系各期細胞的分化，由此制備出能在體外無限擴增的由人骨髓細胞與鼠骨髓瘤細胞融合而制成的粒系白血病融合基因檢測質控參考株，經融合基因的驗證，應用于白血病融合基因檢測的質量控制。

技術領域

本發明涉及醫學領域一種粒系白血病融合基因檢測質控參考株的制備，主要用于急、慢性粒細胞白血病融合基因檢測方法的質量控制。

背景技術

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，分為急性和慢性，前者又分為急性淋巴細胞性白血病(ALL，再分為L1、L2和L3)和急性髓性白血病(AML，再分為M1即急性極微分化型原始粒細胞白血病、M2即急性部分分化型原始粒細胞白血病、M3即急性早幼粒細胞白血病、M4即急性粒-單核細胞白血病及M5即急性單核細胞白血病等)，按造血系統可分為粒細胞系(粒系)白血病、淋巴細胞系(淋系)白血病等。

白血病患者因某些染色體發生易位或重排而產生融合基因，如慢性粒細胞白血病(CML)由t(9；22)(q34；q11)易位形成的BCR-ABL(90％以上)融合基因、急性早幼粒細胞白血病(APL)由t(15；17)(q22；q22)染色體易位形成的PML-RARAα(95％以上)融合基因、急性髓系白血病(AML)最常見的AML1/ETO(41％)和PML-RARa(23％)融合基因、兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)的EL/AML1(占46％)、E2A/PBX1(占20％)、BCR/ABLp190、BCR/ABLp210、MLL/AF4融合基因以及成人ALL患者由于t(9；22)易位而產生的M-bcr/abl和m-bcr/abl融合基因。

總之如BCR-ABL、PML-RARα、AML1-ETO、CBF-MYH11、MLLAF4、TEL-AML1、E2A-PBX1、STE-CAN、TLS-ERG1等都是白血病的常見融合基因，這些基因的檢測對白血病的診斷、治療和預后判斷均有重要的作用。這些基因的檢測可采用熒光原位雜交、免疫印跡、PCR(RT-PCR、RQ-PCR、多重逆轉錄PCR)、FCM、基因芯片技術及全基因組測序等方法。但有很多因素會影響其檢測方法的準確性，Harismendy等報道，不同的NGS平臺假陽性率高達7.8％，等報道，26％的所檢測的基因突變得到不同的解讀，11％的檢測突變得到完全相反的解讀。2016年FDA校準項目(precision FDA)用基因測序公司的操作軟件“閱讀”同一份基因檢測樣本的DNA測序結果，幾乎50％的閱讀軟件無法重復同樣的結果。這就需要研制白血病融合基因檢測的質量控制物質，以監測、校準檢測系統，提高融合基因檢測的準確性。

但作為質控物，需在各個實驗室與被檢標本進行同時檢測或預先用于檢測方法的校準，需要反復試用，其用量很大，需要產業化制備的條件，所以首先要解決的是如何用有限的來自患者的而且是實驗后剩余的骨髓細胞來制備各實驗室反復試用的用量問題。申請人認為應該用細胞永生化的方法來解決這個問題。已知EB病毒轉染法能解決B淋巴細胞的培養擴增，我們也曾采用EB病毒轉染法建立易誤診染色體異常淋巴細胞系并用于淋巴細胞培養和染色體制備的質量控制，但申請人經反復試驗，始終未能使EB病毒轉染骨髓細胞而獲得建系成功，可能是因為EB病毒僅能使成熟B淋巴細胞轉化而不能使骨髓細胞轉化。申請人發現Bodnar等曾報道用端粒酶催化亞單位(hTERT)轉染人體組織細胞，實現了永生化，也發現猴腎病毒的大T抗原(SV40LT)能被用于多種細胞的永生化建株，但經申請人的試驗均未使骨髓細胞永生化，申請人經多年的試驗、研究和文獻檢索，終于從單克隆抗體的制備技術中受到啟發，發現Kohler等曾于1975年將具有抗體產生基因的B淋巴細胞與具有無限擴增性能的骨髓瘤細胞在體外融合，得到兼具骨髓瘤細胞無限繁殖和B淋巴細胞分泌抗體的雜交瘤細胞株，其中來源于B淋巴細胞的抗體產生基因隨著雜交瘤的繁殖而擴增，因被用于單克隆抗體的產業化制備而獲諾貝爾獎。