[發明專利]一種用于檢測尖孢鐮刀菌的核苷酸序列組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201810701040.7
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108841984A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 車團結;徐紅;李琳;沈頌東;曲靜;李亞鵬
• 申請（專利權）人: 蘇州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 胡擁軍;糜婧

1.一種用于檢測尖孢鐮刀菌的核苷酸序列組，其特征在于，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

2.如權利要求1所述的用于檢測尖孢鐮刀菌的核苷酸序列組，其特征在于，還包括如序列表SEQ ID No.4所示的探針，所述探針為熒光標記探針。

3.如權利要求2所述的用于檢測尖孢鐮刀菌的核苷酸序列組，其特征在于，所述探針的5’端標記的熒光報告基團為FAM，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ。

4.一種用于檢測尖孢鐮刀菌的試劑盒，其特征在于，包括如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物和如序列表SEQ ID No.4所示的探針。

5.如權利要求4所述的檢測尖孢鐮刀菌的試劑盒，其特征在于，所述探針的5’端標記的熒光報告基團為FAM，3’端標記的熒光淬滅基團為BHQ。

6.如權利要求4所述的檢測尖孢鐮刀菌的試劑盒，其特征在于，還包括陽性質粒的標準品，所述陽性質粒的標準品是以尖孢鐮刀菌的DNA為模版、經過如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR擴增回收，與pMD18-T質粒進行連接、轉染后得到的。

7.一種用于檢測尖孢鐮刀菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)獲得陽性質粒的標準品：以尖孢鐮刀菌的DNA為模版、經過如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR擴增回收，與pMD18-T質粒進行連接、轉染后得到陽性質粒的標準品；

2)PCR鑒定：分別以待測樣品的DNA、陽性質粒的標準品為模板，以ddH₂O為陰性對照，通過如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物進行PCR反應檢驗。

8.如權利要求7所述的用于檢測尖孢鐮刀菌的方法，其特征在于，步驟2)中，PCR反應體系為：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP(2.5μM)0.5μL、上游引物(1μM)0.5μL、下游引物(1μM)0.5μL、模板0.5μL、Taq酶(5U)0.5μL和ddH₂O補足25μL；

PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30個循環；72℃10min。

9.如權利要求7所述的用于檢測尖孢鐮刀菌的方法，其特征在于，步驟2)中，PCR擴增體系包括如序列表SEQ ID No.4所示的探針。

10.如權利要求7所述的用于檢測尖孢鐮刀菌的方法，其特征在于，PCR反應體系：2×premix 10μL、上游引物(10μM)0.2μL、下游引物(10μM)0.2μL、探針(10μM)0.2μL、模板0.3μL、ddH₂O補足至20μL；

PCR反應條件：94℃預變性2分鐘，94℃10秒、60℃30s并收集熒光信號，40個循環。