[發(fā)明專利]一種杏鮑菇萎銹靈抗性篩選轉化載體及其構建方法和應用

在審

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• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN109055420A
• 公開（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設計）人: 尚俊軍;鮑大鵬;李燕;李焱;楊瑞恒;汪瀅;茅文俊;唐利華
• 申請（專利權）人: 上海市農業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/66;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;魏峯

本發(fā)明涉及一種杏鮑菇萎銹靈抗性篩選轉化載體及其構建方法和應用，將帶有點突變的琥珀酸脫氫酶鐵硫亞基的DNA片段連入質粒載體，記為pTSdi。本發(fā)明的轉化載體可以用于轉化杏鮑菇，使其獲得對真菌殺菌劑萎銹靈的抗性；另外由于在構建的轉化載體中留有插入外源基因片段的酶切位點，可以方便地插入感興趣的外源基因，轉化到杏鮑菇中進行遺傳學研究，具有良好的應用前景。

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學領域，特別涉及一種杏鮑菇萎銹靈抗性篩選轉化載體及其構建方法和應用。

背景技術

近年來我國杏鮑菇的工廠化栽培發(fā)展迅速，成為繼金針菇之后發(fā)展最快的設施栽培食用菌品種。利用現代分子生物學技術改良杏鮑菇品種，獲得產量高、生長周期短、抗雜菌能力強的菌株，是杏鮑菇遺傳研究的重要課題。構建杏鮑菇的遺傳轉化系統首先要建立分子生物學工具，如抗性篩選標記和驅動外源基因表達的啟動子等。

通常對基因進行點突變需要購買商業(yè)試劑盒，價格不菲而且操作繁瑣。因此，引入突變位點的DNA序列可以為構建萎銹靈抗性遺傳轉化載體提供基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種杏鮑菇萎銹靈抗性篩選轉化載體及其構建方法和應用，解決了實現對基因進行點突變成本過高的問題。

本發(fā)明提供了一種杏鮑菇萎銹靈抗性篩選轉化載體，將帶有點突變的琥珀酸脫氫酶鐵硫亞基的DNA片段連入質粒載體，記為pTSdi。

本發(fā)明還提供了一種杏鮑菇萎銹靈抗性篩選轉化載體的構建方法，包括：

(1)提取杏鮑菇單核菌絲全基因組DNA，檢測DNA質量和濃度；

(2)在需要進行點突變的位置引入一對互補引物sdi2F和sdi1R；以提取的基因組DNA為模板，利用正向引物sdi1F和反向引物sdi1R擴增第一部分的DNA片段；以提取的基因組DNA為模板，利用正向引物sdi2F和反向引物sdi2R擴增第二部分的DNA片段；利用限制性內切酶MfeI消化兩部分DNA片段，再采用T4連接酶將消化后的兩部分DNA片段連接成完整DNA片段；

(3)將完整DNA片段通過TA載體連接，導入pGEM-Teasy質粒載體中，獲得轉化載體pTSdi。

所述步驟(2)中的sdi1F的序列為：TCACGTCCTCAATAAGCGCTC；

sdi1R的序列為：ACAATTGAAAATGGTGAGGC；

sdi2F的序列為：GCCTCACCATTTTCAATTGT；

sdi2R的序列為：AGCACCGCAAGTGAGACCAA。

上述引物為PCR擴增琥珀酸脫氫酶復合物的鐵硫蛋白亞基的引物。

本發(fā)明還提供了一種杏鮑菇萎銹靈抗性篩選轉化載體的應用，應用于攜帶外源基因進行杏鮑菇的遺傳轉化。

有益效果

本發(fā)明的轉化載體可以用于轉化杏鮑菇，使其獲得對真菌殺菌劑萎銹靈的抗性；另外由于在構建的轉化載體中留有插入外源基因片段的酶切位點，可以方便地插入感興趣的外源基因，轉化到杏鮑菇中進行遺傳學研究，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為用于構建轉化載體pTSdi的引物位置；

圖2為本發(fā)明轉化載體pTSdi的示意圖；

圖3為利用PCR結合酶切鑒定杏鮑菇轉化子的示意圖。

具體實施方式