[發明專利]用于檢測C反應蛋白的試劑的制備方法

在審

• 申請號: 201810695967.4
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108761090A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 耿英利;甘萍萍;黎明;吳昌英;龍騰鑲
• 申請（專利權）人: 邁克生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 王子曄;張穎玲

本發明涉及一種制備用于檢測CRP的試劑的方法，包括1)使用緩沖液稀釋第一微球和第一抗體，得到所述第一微球與第一抗體的混合溶液，加入交聯劑進行孵育，加入封閉劑封閉，得到經標記的第一微球；2)使用緩沖液稀釋第二微球和第二抗體，得到所述第二微球與第二抗體的混合溶液，加入交聯劑進行孵育，加入封閉劑封閉，得到經標記的第二微球；3)將所述經標記的第一微球與經標記的第二微球混合；其中，所述第一微球和第二微球為直徑不同的羧基微球；所述第一抗體與第二抗體不同；所述緩沖液的pH為6.3～9.5。本發明還涉及由該方法制備得到的試劑及含有該試劑的試劑盒。

技術領域

本發明屬于免疫檢測領域，具體涉及一種制備用于檢測C反應蛋白的試劑的方法。

背景技術

C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)由肝細胞合成，在胎兒期產生，非母體胎盤傳遞。其產生機理是：當機體受感染或組織受損傷時巨噬細胞和其他白細胞等被激活，產生白細胞介素-6、白細胞介素-1、腫瘤壞死因子TNF-a等細胞因子及其他介導物，這些細胞因子和介導物到達肝臟，刺激肝細胞和上皮細胞合成CRP。在結構上，CRP含5個多肽鏈亞單位，非共價地結合為盤形多聚體，分子量為11.5萬～14萬，CRP是一種典型的急性時相蛋白。

CRP可用于評價感染，組織損傷和炎癥性疾病。參考值通常被認為是臨床上含量高于10mg/L。在健康人群血液中CRP水平低于5mg/L，而在各種條件下，急性炎癥4～8小時內，CRP值達到約20至500mg/L。作為急性炎癥評估指標比紅細胞沉降率(ESR)和白細胞計數更敏感、更可靠。研究表明，低濃度的CRP(＜3mg/L)也可作為心血管疾病風險識別的輔助手段。配合傳統的急性冠脈綜合征臨床診斷使用，可作為冠狀動脈疾病或急性冠脈綜合征復發的預警指示物。免疫學檢測方法主要有酶免疫測定法、免疫比濁法、膠體金免疫測定法、化學發光測定法、熒光免疫測定法、放射免疫測定等。其中，使用微球的免疫學方法制備的診斷試劑，由于能夠為自動分析儀器所利用，因此近年來在臨床檢查等中被廣泛使用。在將微球用于免疫檢測診斷時，通常使用與測定對象結合的待標記物對微球進行標記。在樣本中含有測定對象時，通過使其與微球所負載的待標記物結合，引起微球凝集。從而通過測定該凝集的程度，確定測定對象的有無或其含量。

目前，微球與待標記物連接方法主要有物理吸附和化學偶聯。其中，化學偶聯是利用活化交聯劑將待標記物和微球通過化學反應連接在一起，連接后的穩定性較物理吸附更好(JL Ortega-Vinuesa et al.,Journal of Colloid & Interface Science,1995)。用于化學偶聯的微球表面會修飾有一些化學基團，如羧基、氨基和羥基(對應于羧基微球、氨基微球和羥基微球)等。而在這些之中，羧基微球應用更為廣泛。

利用活化劑制備羧基微球的方法是眾所周知的，比如CN106353507A公開了一種將抗體偶聯至微球的方法，該方法在用緩沖液重懸微粒后加入EDC和sulfo-NHS活化反應15分鐘，反應后離心清洗并超聲重懸；隨后將溶解的抗體與微粒混合再進行偶聯反應，偶聯后需再次進行離心清洗及重懸。又如CN105606822A公開了一種使用抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒的方法，具體用pH5.0的MES洗滌膠乳三次并超聲分散，加入EDAC活化15分鐘，洗滌2次并超聲分散，然后依次加入抗體混合，封閉得到致敏顆粒。

然而，上述方法在制備過程中不僅需要進行離心以去除游離的活化劑和游離未結合的抗體，還需要對微球進行超聲重懸以使其分散。這些步驟雖然去除了多余組分并解決了羧基微球制備時易凝集的問題，但使得操作過程變得效率低且耗時，不利于工業化制備。

針對這種情況，已提出了不需純化的方法，例如在CN107167586A公開了這樣的方法：先將膠乳加到緩沖液，在加入EDC進行活化15分鐘，之后調節pH至7.60，再加入SLO進行交聯反應2h，最后加入兩種封閉劑封閉得到成品的方法，該方法不需要進行離心或超濾步驟，從而提高制備效率。