[發明專利]一種4-甲基傘形酮富集材料及其用途

有效

• 申請號: 201810693702.0
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108948229B
• 公開（公告）日: 2021-08-06
• 發明（設計）人: 梁曉聲
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C08B37/12
• 分類號: C08B37/12;C12Q1/10;C12Q1/06
• 代理公司: 武漢華旭知識產權事務所 42214
• 代理人: 劉天鈺

本發明提供了一種4?甲基傘形酮富集材料，所述富集材料為采用以下方法制備：將瓊脂糖與NaOH溶液和二甲基亞砜進行混合，其中瓊脂糖：NaOH：二甲基亞砜的質量比為1:0.2～5:1～10，將混合物置于恒溫水浴條件下，邊攪拌邊加入鹵代烴或鹵代酸，瓊脂糖與鹵代烴或鹵代酸的質量比為1:0.2～5，加入完畢后繼續攪拌并恒溫反應至反應結束，然后用丙酮和去離子水清洗，離心分離后干燥，即制得4?甲基傘形酮富集材料。通過該材料在培養管底部的引入，當培養管中加入大腸桿菌和大腸埃希氏菌各自的顯色/熒光底物培養基培養時，可以實現一根培養管同時測定大腸桿菌和大腸埃希氏菌。

技術領域

本發明提供了一種4-甲基傘形酮富集材料，該材料用于同時測定大腸桿菌和大腸埃希氏菌中，屬于微生物檢測技術領域。

背景技術

大腸菌群是衡量食品衛生狀況、尤其是存在腸道致病菌潛在威脅的重要指標，因而也是幾乎任何食品都必須檢測的重要微生物項目。傳統的檢測方法基于發酵乳糖，產酸和產氣，培養時間24-96h。但是由于大腸桿菌厭氧株的發現(Appl EnvironMicrobiol.1982 43(6):1320–1329.)，以產氣作為鑒定依據在某種程度上就失去了意義。

大腸菌群測試更多采用測定β-半乳糖苷酶的方法來替代乳糖發酵試驗，通過培養溫度控制為44.5℃來抑制非腸道來源的其它具有β-半乳糖苷酶的格蘭氏陰性菌生長。測定β-半乳糖苷酶常用的底物有4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷(MUGal)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、鄰硝基酚-β半乳糖苷(ONPG)等。當這些試劑中的半乳糖苷被大腸菌群產生的半乳糖苷酶水解后，產生熒光或顏色產物，從而實現大腸菌群的快速鑒別。大腸埃希氏桿菌同樣作為衛生學指標來指示環境及樣品是否有糞便污染。4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養基用于大腸埃希氏桿菌快速檢測。(GB/T 4789.32-2002,GB/T 5750.12-2006)。細菌的葡萄糖醛酸苷酶在堿性條件下，作用于4-甲基傘形酮-β-D葡萄糖醛酸苷(4-Methylumbellifery-β-D-Glucuronide簡稱MUG)的β-葡糖醛酸苷鍵，使其水解，釋放的4-甲基傘形酮在366nm紫外燈下產生藍白色熒光。97％的大腸埃希氏桿菌、10％的沙門氏菌以及少量的志賀氏菌具有葡萄糖醛酸苷酶。1995年該方法被美國國家環境保護署采納(Code ofFederal Regulations 40,141.21Protection of Environment)。有關大腸菌群具有β-半乳糖苷酶的特性，ISO 9308-1:2000已給予了明確的定義。近年來，大腸桿菌和大腸埃希氏菌的檢測主要通過含有上述底物的平板顯色檢測，如：法國生物梅里埃公司、法國科馬嘉公司、英國OXOID公司、北京陸橋技術有限責任公司、青島海博生物技術有限公司及廣東環凱生物技術有限公司等的相關產品。酶底物平板法自動化程度不高，陽性菌落計數繁瑣且易因稀釋不精確而出現計數誤差。

美國IDEXX公司開發了一種基于計數盤的大腸桿菌和大腸埃希氏菌同時檢測方法。水樣與含兩種顯色/熒光底物的培養基粉末混合，倒入分為若干區室的定量盤內，密封培養。當稀釋濃度合適，每個區室只有1個菌或0個菌。結果可以很方便跟MPN方法關聯，使用該方法24小時以內可以實現大腸埃希氏菌和總大腸桿菌的快速檢測。然而，上述方法對稀釋度要求較高，當稀釋不合理時，容易出現全板陽性或全板陰性無法計數，腸桿菌科一般生長較快，24小時實現定量時間還是顯得略長，不能完全滿足飲用水檢測及環保執法的要求。鑒于上述需求，美國Neogen公司開發了Biolumix實時微生物熒光光電快速檢測系統，通過溶液培養實時監測熒光及顏色變化，實現了大腸桿菌、大腸埃希氏菌及其他微生物無需稀釋10小時內快速檢測。快速培養-顯色/熒光的方法無需樣品稀釋，容易做成在線自動化儀器，培養時間短，在環保領域具有較大的優勢。然而水體衛生學指示菌檢測通常總大腸桿菌及大腸埃希氏菌指標都需要檢測，實際檢測時需要兩次培養測定。如兩個檢測的熒光/顏色底物同時加入一個培養管，顏色產物通常是較好的熒光淬滅劑會淬滅可能的熒光產生，不利于熒光結果的判讀。

發明內容