[發(fā)明專利]柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810693224.3
• 申請(qǐng)日: 2018-06-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108796049B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚利曉;陳善春;何永睿;彭蘊(yùn);雷天剛;許蘭珍;鄒修平;彭愛(ài)紅;李強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/6895
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

本發(fā)明公開(kāi)了一種柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括12對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:3～26所示。還公開(kāi)了一種柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族的熒光定量PCR檢測(cè)方法，提取待測(cè)樣品的總RNA，采用前述的試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。本申請(qǐng)?zhí)峁┑?2對(duì)引物能夠通過(guò)熒光定量PCR方法快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族中的柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為防治柑橘黃龍病等的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

胼胝質(zhì)是以β-1,3糖苷鍵結(jié)合的線性葡聚多糖，屬于細(xì)胞壁的特殊組分或是與細(xì)胞壁結(jié)合的物質(zhì)，在植物中并非普遍存在，僅占細(xì)胞壁總重的0.3％-5％。胼胝質(zhì)在細(xì)胞分裂時(shí)會(huì)在細(xì)胞板積累，并可沉積在胞間連絲周圍調(diào)控胞間運(yùn)輸能力，也可出現(xiàn)在韌皮部篩孔板孔處。篩孔是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)分子長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ溃虼耍蓦召|(zhì)的合成、積累和降解受到嚴(yán)格的調(diào)控以保障整株植物中物質(zhì)的運(yùn)輸。

胼胝質(zhì)由胼胝質(zhì)合成酶(callose synthase,CalS)以UDP-葡聚糖為底物催化合成。CalS是一種分子量較大的蛋白，具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，含有3個(gè)保守的功能域Vta1、FKS1和glucan synthase。擬南芥中含有12個(gè)CalS基因，這些基因在細(xì)胞板的形成、調(diào)節(jié)胞間連絲空隙、花粉發(fā)育、篩孔及纖維形成、韌皮部運(yùn)輸、配子發(fā)育、氣孔形成及抗生物學(xué)和非生物學(xué)逆境等過(guò)程中具有不同的調(diào)節(jié)功能。

柑橘黃龍病(HuangLongBing，HLB)是影響柑橘產(chǎn)業(yè)的一種非常嚴(yán)重的系統(tǒng)性侵染病害，被稱為柑橘產(chǎn)業(yè)的“癌癥”。該病主要由韌皮部專性寄生的難培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌(Candidatus Liberibacter Asianian,CLas)引起。感染黃龍病的柑橘出現(xiàn)葉片斑駁狀黃化，果實(shí)部分著色,使得產(chǎn)量降低、品質(zhì)劣變，甚至樹(shù)體死亡。asaoka等(Y MasaokaAPustika，2014)和Marcos等(V MafraPK Martins，2013)的研究均發(fā)現(xiàn)，感染柑橘黃龍病后在篩板的篩孔中伴隨有胼胝質(zhì)和韌皮部蛋白沉積的現(xiàn)象，推測(cè)認(rèn)為胼胝質(zhì)的過(guò)度積累導(dǎo)致韌皮部堵塞，光合產(chǎn)物運(yùn)輸受阻，葉肉中淀粉過(guò)度積累，葉綠素被破壞，最終導(dǎo)致葉片出現(xiàn)失綠癥狀。進(jìn)一步研究柑橘中胼胝質(zhì)合成酶基因在柑橘中的表達(dá)情況和對(duì)黃龍病病原的應(yīng)答機(jī)制具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題提供一種柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。

實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案是：

一種柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括12對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:3～26所示。

所述的檢測(cè)試劑盒，還包括2×SYBRG熒光染料。

一種柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族的熒光定量PCR檢測(cè)方法，提取待測(cè)樣品的總RNA，利用上述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

所述的熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為12μL體系：4.4mL H₂O，0.3μL 10mM上、下游引物，6μL 2×SYBRG熒光染料，1μL cDNA。

熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果是：本申請(qǐng)?zhí)峁┑?2對(duì)引物能夠通過(guò)熒光定量PCR方法快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因家族中的柑橘胼胝質(zhì)合成酶基因，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為防治柑橘黃龍病等的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為CsCalS家族中功能域和跨膜區(qū)。

圖2為柑橘與擬南芥中CalS基因編碼氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。