[發(fā)明專利]一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810692916.6
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN108841806B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設計）人: 張?zhí)?/a>
• 申請（專利權）人: 深圳市夏盟生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市深弘廣聯(lián)知識產權代理事務所(普通合伙) 44449
• 代理人: 向用秀

一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，涉及酶的基因工程技術領域。本發(fā)明公開了由米曲霉(Aspergillus oryaze)脂肪酶作為親本，經分子生物學技術而獲得的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體。在這個突變體的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突變?yōu)椋篏ly57Glu。以該突變體在不同溫度條件下保溫10min后失去50％酶活力的溫度(T_50％¹⁰)及50℃的半衰期(t₅₀^1/2)表示，該突變體的熱穩(wěn)定性得到了提高，具有較高的實際應用價值和廣闊的市場前景。

技術領域

本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，具體地說涉及利用分子生物學技術獲得熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，屬于酶的基因工程技術領域。

背景技術

近年來，脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)在工業(yè)應用方面取得了很大進展。脂肪酶具有對底物水解效率高、反應溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點，已經在洗滌、造紙、制革、食品、紡織等領域得到了廣泛的應用，并已經成為全球酶制劑市場上重要的品種。脂肪酶可以從動、植物中提取，也可以由多種微生物產生。由于微生物脂肪酶種類多，來源廣，周期短，便于工業(yè)生產和提純，所以在各領域中得到了極為廣泛的應用中。米曲霉是一種非常安全的產酶菌，目前已經被美國FDA和WHO認定為安全菌株(GRAS)，它所分泌的脂肪酶AOL3(GenBank AB039325)具有安全無毒，作用底物廣，對中、長鏈的甘油三脂的選擇性高等優(yōu)勢(Toida J,FukuzawaM,Kobayashi G,Ito K, Sekiguchi J.Cloning and sequencing of thetriacylglycerol lipase gene of Aspergillus oryzae and its expression inEscherichia coli.FEMS Microbiol Lett. 2000,189:159-164.)，在食品、洗滌和生物柴油領域展現(xiàn)出了重要的應用潛力。但是很多食品、洗滌劑以及生物柴油的制備或者使用過程都需要在較高溫度下進行，而AOL3屬于中溫脂肪酶，在50℃下的半衰期不到2min，熱穩(wěn)定性差。這不僅顯著地提高了AOL3的應用成本，而且限制了它的應用領域，急需對其熱穩(wěn)定性進行改良和提高。

定向進化屬于非理性設計，是指通過在實驗室中模擬達爾文自然進化過程，針對某一蛋白質酶的基因，通過隨機突變人為制造大量突變，然后按照特定的需要和目的給予選擇壓力，篩選出具有期望特征的蛋白質，實現(xiàn)分子水平的模擬進化。近10年來，定向進化技術已經在脂肪酶性質改造領域取得了巨大的成功，主要集中于提高酶的熱穩(wěn)定性，提高酶的催化活力，改進底物特異性，對應立體選擇性等方面(Katja Zorn,Isabel Oroz-Guinea, Henrike Brundiek,Uwe T.Bornscheuer.Engineering and application ofenzymes for lipid modification,an update.Prog Lipid Res.2016,63:153-164)。

大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強等特點，是分子生物學研究和生物技術產業(yè)化發(fā)展進程中的重要工具。在前期研究中，發(fā)明人已經成功將米曲霉脂肪酶AOL3在大腸桿菌中進行了高效表達。本發(fā)明以大腸桿菌為表達系統(tǒng)，利用易錯PCR和定向進化技術對米曲霉脂肪酶AOL3進行大量隨機突變和篩選，獲得了熱穩(wěn)定性顯著提高的脂肪酶突變體。

酶分子的熱穩(wěn)定性提高可以用半衰期(t^1/2)來表征。即在較高溫度條件下，酶的活力降低到原來活力一半時所需的時間。半衰期長，則酶穩(wěn)定性高。反之，熱穩(wěn)定性差。因此，t^1/2的提高代表了酶分子熱穩(wěn)定性的提高。本發(fā)明中的t₅₀^1/2表示在50℃條件下，脂肪酶及其突變體的半衰期。

酶分子的熱穩(wěn)定性提高還可以用T_50％¹⁰來表征。即在不同溫度條件下對酶分子孵育10min，獲得酶分子活力失去50％的溫度，此溫度越高表示酶分子熱穩(wěn)定性越強。