[發明專利]一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的PCR擴增引物、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201810685968.0
• 申請日: 2018-06-28
• 公開（公告）號: CN108841945B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 李偉;朱新平;徐紅艷;趙建;陳辰
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6879
• 分類號: C12Q1/6879;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

林本發明公開了一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的PCR擴增引物，包括一對性別特異性分子標記引物和一對內參基因引物，還公開了一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的PCR方法，以及快速鑒定中華鱉遺傳性別的試劑盒。該擴增引物可在中華鱉早期鑒定出其遺傳性別。該方法成本低、操作簡便、可進行大批量快速鑒定，結果直觀準確。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的PCR擴增引物、方法及試劑盒。

背景技術

中華鱉(Pelodiscus sinensis)隸屬的龜鱉目(Chelonia)是四足動物中最古老的一類，是產無羊膜卵兩棲動物演變成產羊膜卵爬行動物的聯結點。在研究物種形態演化、生殖方式進化等領域具有獨特的科研價值。隨著龜鱉養殖業的迅速發展，更增添了其舉足輕重的經濟價值。2016年，中華鱉的全國總產量達34余萬噸，屬于經濟價值較高的名特優水產養殖品種，是淡水養殖中的重要組成部分。

一直以來，水產養殖業選取效益較高的性別進行單性養殖，是很多學者研究的目標，中華鱉養殖業也具有高效全雄繁育的需求。目前，在中華鱉養殖過程中存在一個普遍的現象：養殖周期內，經過2～3次篩選分塘，“去雌留雄”，最終實現單養雄鱉的養殖模式。在其生長期，雄鱉比雌鱉生長快，且高密度下性成熟鱉雌雄混養易引發個體激烈間爭斗，導致皮膚破損，爆發疾病感染，降低鱉的成活率和上市的品質。然而，中華鱉養殖周期長、性成熟晚，雌雄要到1冬齡以上才能夠通過外形鑒別，且鑒別效率低。如果能在中華鱉出殼后就對其遺傳性別進行鑒定，可以在鱉苗早期就實現單性分塘養殖，養殖成本可以相應降低，其產量和效益也會顯著提高。

一般來說，脊椎動物性別決定機制大致可以分為遺傳性別決定(genetic sexdetermination,GSD)和環境性別決定(environmental sex determination,ESD)。不同于哺乳動物、鳥類等高等脊椎動物的體性別決定依賴于遺傳物質，龜鱉類處于動物性別決定方式由環境決定型到基因決定型的過渡環節，為中華鱉性別決定機制的闡明帶來了困難。目前，對中華鱉性染色體及性別決定方式的研究已開展了一些，但尚無統一的答案。隨著生物技術的發展，對中華鱉性別決定方式的認定由開始的溫度依賴型(TSD)機制逐漸發展為基因決定型(GSD)機制的(ZZ/ZW型)。此外，有學者揭示出中華鱉的W性染色體的18S rRNA拷貝數比Z大很多，并設計了利用qPCR檢驗18S rRNA擴增的重復拷貝數的方法來鑒別雌雄，成功率為90％，但該方法成本昂貴、操作繁瑣，且有10％的錯誤率。

隨著測序成本的下降及生物信息分析技術的發展，全基因組測序方法的使用成為水產類性別研究的新趨勢。2013年以來，中華鱉和綠海龜(Chelonia mydas)等龜鱉動物的全基因組序列陸續發布，為挖掘龜鱉動物性別特異標記及揭示其性別決定機理帶來新的契機及信息技術平臺。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的PCR擴增引物，該擴增引物可在中華鱉早期鑒定出其遺傳性別。

本發明的第二個目的在于提供一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的PCR方法，該方法成本低、操作簡便、可進行大批量快速鑒定，結果直觀準確。

本發明的第三個目的在于提供一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的試劑盒。

本發明的上述第一個目的是通過以下技術方案來實現的：一種快速鑒定中華鱉遺傳性別的PCR擴增引物，包括一對性別特異性分子標記引物和一對內參基因引物，其中：

所述性別特異性分子標記引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述性別特異性分子標記引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述內參基因引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示；

所述內參基因引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示。