[發明專利]一種基于核酸適配體的循環聚合免標記熒光檢測PD-1的方法

在審

• 申請號: 201810684803.1
• 申請日: 2018-06-28
• 公開（公告）號: CN108823281A
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 姜廷福;呂爽
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種基于核酸適配體的循環聚合免標記熒光檢測PD?1的方法。本發明涉及一種信號放大技術熒光光譜傳感器的構建和應用。將自行設計的DNA單鏈與程序性死亡受體（PD?1）核酸適體互補雜交，加入待測物質PD?1后，由于其與核酸適體間的結合力大于DNA雙螺旋的配位能力，導致DNA雙鏈解旋。釋放出來的DNA單鏈在各種工具酶作用下循環擴增，級聯信號放大。擴增產物通過構象改變引發熒光信號，實現PD?1的高靈敏度高選擇性核酸光學傳感檢測。依靠這種方法，PD?1的檢測限可以達到0.3 ng/mL，可滿足于血清等生物樣品中PD?1的檢測。

技術領域

本發明屬于分析化學和生物傳感檢測領域，涉及一種信號放大技術熒光光譜傳感器的構建和應用。另外，本發明還涉及采用所述的熒光光譜傳感器檢測程序性死亡受體（PD-1）的方法。

背景技術

程序性死亡受體（programmedcell death-1, PD-1）是一種主要表達在 T 細胞上的共受體，與其配體（PD-L1/PD-L2）結合能夠抑制 T 細胞的活化，使機體免受自身免疫系統的攻擊（Tumeh P. C., Harview C. L., Yearley J. H., et al. Nature, 2014, 515:568-571）。除了調節并維持自身免疫耐受，在腫瘤細胞中 PD-L1 的表達上調，而在被病毒感染的 T 細胞中 PD-1 的表達也會上調，PD-1/PD-L1 信號通路參與了腫瘤細胞及傳染性病原體的免疫逃逸，因此阻斷 PD-1/PD-L1 信號通路已成為腫瘤和慢性傳染病研究的熱點。但當人們慶祝這些前所未有的治療進展時，癌癥專家卻逐漸意識到這種強大的新療法的局限性。近期研究結果表明， PD-1抑制劑治療腫瘤的療效取決于腫瘤細胞是否表達 PD-1，對于低表達甚至不表達 PD-1 的腫瘤類型，應用該類抗體療效欠佳（Teixido C.,Karachaliou N., Gonzalez-Cao M., et al. Cancer Biol. Med., 2015, 12 (2): 87-95）。因此，建立PD-1的高靈敏度高特異性檢測新方法，可為針對性的PD-1腫瘤免疫靶向治療和創新性PD-1抑制劑的開發提供理論依據與物質基礎，具有重要的理論意義和實際應用價值。

目前對于PD-1的檢測方法與其他蛋白一樣，多采用傳統的酶聯免疫吸附測試、Western Blot、免疫熒光技術和免疫組化技術等（范德環, 張學光, 奚沁華, 張光波, 等.免疫學雜志, 2015, 31: 799-802）。而這些方法存在實驗過程復雜、操作繁瑣、效率低、特異性不理想等缺點，不適合于以癌癥患者合理用藥和治療監控為目的的PD-1活性檢測。核酸適體（aptamer）是通過指數富集配基的系統進化技術（SELEX）體外篩選得到的一組能與靶分子高親和、高特異性結合的寡核苷酸序列（單鏈DNA或RNA）（Tuerk C., Gold L.Science, 1990, 249: 505-510）。以不同類型的示蹤分子標記適體后，該類適配體探針可以直觀地將適配體與靶分子的特異性識別轉化為靈敏的示蹤信號，從而為金屬離子、有機小分子、核酸和蛋白質等大分子乃至細胞等的檢測提供一種靈敏、特異的新型模式。核酸適體對目標物的識別原理和抗體類似，但相對于抗體而言，適體具有合成簡單、易于標記、穩定性好、適用范圍寬和靈敏度高等優點。近年來，基于核酸適體的生物傳感器用于蛋白質的分析研究引起了人們的廣泛興趣（Kim Y. S., RastonN. H. A., Gu M. B. Sens.Actuators B, 2016, 76: 12-19）。最近，Prodeus研究組報道了PD-1核酸適體用于靶向免疫治療的研究（Prodeus A., Abdul-Wahid A., Fischer N. W., et al. MolecularTherapy-Nucleic Acids, 2015, 4 (4): e237）。然而，將核酸適體傳感技術用于PD-1的檢測分析，至今尚未見文獻報道。因此，建立以核酸適體傳感技術為基礎的PD-1高特異性檢測新方法，可為惡性腫瘤及炎癥等相關疾病患者合理用藥和治療監控提供強有力的分析手段。

發明內容