[發(fā)明專利]核酸適體酶聯(lián)檢測試劑盒和制備方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2018-06-27
• 公開（公告）號: CN108957001B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方曉紅;張振;董再再;徐麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/535;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京辰權(quán)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11619
• 代理人: 佟林松

本發(fā)明涉及核酸適體酶聯(lián)檢測試劑盒和制備方法及其用途，該核酸適體酶聯(lián)檢測試劑盒，包括核酸適體板、陰性對照、陽性對照、樣品稀釋液、酶標抗體、洗滌液、顯色液A&B、終止液和封口膜；其中，核酸適體板為VEGF核酸適體修飾的酶聯(lián)板；酶標抗體為辣根過氧化物酶標記血管內(nèi)皮細胞生長因子單克隆抗體。本發(fā)明的核酸適體酶聯(lián)檢測試劑盒具有結(jié)果穩(wěn)定準確、特異性強、靈敏度高、使用方便、價格低廉、便于推廣的優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于核酸適體的人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的酶聯(lián)檢測試劑盒及其制備。

背景技術(shù)

1990年，美國哈佛大學(xué)Folkman博士提出著名的Folkman理論，腫瘤組織生長，必須依靠新生血管生成提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)來維持。2000年Hanahan和Weinberg在Cell綜述了腫瘤細胞具有六種獲得性能力，并列舉了各自的可能機制，其中也提到了“持續(xù)血管生成是腫瘤的重要標志之一”。而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是最有效的血管形成因子之一，對內(nèi)皮細胞具有特異性分裂能力。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白。兩條分子量各為24kDa的單鏈以二硫鍵組成二聚體。其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管內(nèi)皮細胞促進血管內(nèi)皮細胞增殖，增加血管通透性。

一般腫瘤患者確診時都到了中晚期，早期篩查并對可疑患者或無癥狀患者及時診斷，可以提高腫瘤患者的生存率，延長生存時間。早發(fā)現(xiàn)和早治療是腫瘤篩查的重要意義。腫瘤分子診斷試劑多作為基因突變位點的檢測，變異的腫瘤細胞產(chǎn)生即可測出。但部分正常人群中存在處于休眠狀態(tài)的腫瘤細胞，有些休眠期可長達10年，此時測出無法確診，只能做為腫瘤風(fēng)險性評估，不具篩查意義，并且會對篩查對象產(chǎn)生極大憂患。目前在應(yīng)用的腫瘤標志物絕大多數(shù)對應(yīng)1-3種腫瘤，特異性大多在75％左右，敏感性在30％-90％，篩查時多選擇幾種常見的腫瘤標志物組成體檢套餐，篩查廣譜性不夠且檢驗費用較高。VEGF被認為是最有意義的血液腫瘤篩查的標記物。VEGF可篩查幾乎所有實體腫瘤，它的廣譜性是其他檢測指標不可替代的。此外，VEGF參與許多血管生成依賴性疾病的發(fā)病及其進展，除了癌癥外，還包括某些炎性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)以及糖尿病視網(wǎng)膜病變等。

目前血清VEGF的檢測主要有基于抗原抗體識別的酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受抗體的限制，ELISA的靈敏度不高，檢測范圍有限，IRMA試劑盒受同位素半衰期的影響，有效期短，臨床上只能手工操作，工作量大而且還易產(chǎn)生人為誤差，此外還有一定的放射性污染。為了提高血清VEGF的檢測靈敏度，國內(nèi)有公司采用了VEGF受體和單克隆抗體同時固定到酶標板上，以此增加VEGF的捕獲效率提高靈敏度達到pg/ml(北京健平九星生物醫(yī)藥科技有限公司)，然而昂貴的VEGF受體使得試劑盒價格大幅提高。此外，也有文獻報道采用多步信號放大方法提高靈敏度(Biosensors and Bioelectronics,2016,86,990–995；Biosensors and Bioelectronics,2017,89,964–969)，但因為操作過程復(fù)雜，無法實現(xiàn)臨床上的試劑盒制作。因此，開發(fā)出一種簡單快速、靈敏度高、價格便宜、易于制作成臨床檢測試劑盒的VEGF方法在臨床診斷中具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為解決以上問題的至少一個，本發(fā)明提供一種基于核酸適體的人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的ELISA檢測試劑盒。該試劑盒具有結(jié)果穩(wěn)定準確、特異性強、靈敏度高、使用方便、價格低廉、便于推廣的優(yōu)點。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種核酸適體酶聯(lián)檢測試劑盒，包括核酸適體板、陰性對照、陽性對照、樣品稀釋液、酶標抗體、洗滌液、顯色液A&B、終止液和封口膜。

其中，核酸適體板為VEGF核酸適體修飾的酶聯(lián)板；酶標抗體為辣根過氧化物酶標記血管內(nèi)皮細胞生長因子單克隆抗體。

其中，陽性對照為人血管內(nèi)皮細胞生長因子蛋白凍干粉；陰性對照為動物血清凍干粉。