[發(fā)明專利]一種人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810669871.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-26
• 公開（公告）號(hào): CN108977525A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王文忠;胡軍;田軍龍;陳蘇平;卜云璇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州道爾盾基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6872;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 韓飛

1.一種人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括如下步驟：

(1)針對(duì)ABCG2和SLC2A9基因設(shè)計(jì)特異性引物；

(2)利用特異性PCR擴(kuò)增出包含ABCG2和SLC2A9基因的目的片段；

(3)利用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物片段；

(4)進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)；

(5)進(jìn)行脫鹽純化處理；

(6)通過核酸質(zhì)譜儀檢測(cè)分析目標(biāo)基因ABCG2和SLC2A9基因的序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(1)中設(shè)計(jì)的特異性引物包括用于擴(kuò)增ABCG2和SLC2A9基因基因的特異性引物對(duì)，所述特異性引物對(duì)包含三條ABCG2基因的正向引物S EQ ID Nos：1、SEQ ID Nos：3、SEQ ID Nos：5，和三條ABCG2基因的反向引物SEQ ID Nos：2、SEQ ID Nos：4、SEQ ID Nos：6，以及一條SLC2A9基因的正向引物SEQ ID Nos：7，和一條SLC2A9基因的反向引物SEQ ID Nos：8。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)中特異性PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃熱啟動(dòng)，10分鐘；95℃變性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸，5分鐘。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(3)中的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化處理?xiàng)l件為：37℃消化處理45分鐘，85℃加熱變性5分鐘，冰浴10分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(3)中的限制性內(nèi)切酶為蝦堿性磷酸酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中單堿基延伸反應(yīng)包括ABCG2和SLC2A9基因的單堿基延伸引物，所述ABCG2基因的單堿基延伸引物包含四條單堿基延伸引物SEQ ID Nos：9，SEQ ID Nos：10，SEQ ID Nos：11，SEQ ID Nos：12，所述S LC2A9基因的單堿基延伸引物包含一條單堿基延伸引物SEQ IDNos：13。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中單堿基延伸反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃熱啟動(dòng)，1分鐘；95℃變性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸，3分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(6)的核酸質(zhì)譜檢測(cè)的具體步驟為：

(1)在樹脂板上鋪好待用樹脂，風(fēng)干5-10分鐘；

(2)向樣本板的反應(yīng)孔中加入待測(cè)的樣本，補(bǔ)充25ul ddH₂O，用封口膜密封，3000轉(zhuǎn)/分鐘瞬時(shí)離心；

(3)除去封口膜，將樣本板倒扣在步驟(1)的樹脂板上固定，然后將樣本板和樹脂板一起翻轉(zhuǎn)，使風(fēng)干的樹脂落入樣本板的反應(yīng)孔內(nèi)，用封口膜密封，3000轉(zhuǎn)/分鐘瞬時(shí)離心；

(4)將樣本板置于旋轉(zhuǎn)器上慢速旋轉(zhuǎn)20分鐘，再3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，然后點(diǎn)樣上機(jī)，用核酸質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

9.一種人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括用于擴(kuò)增ABCG2和SLC2A9基因基因的特異性引物對(duì)，所述特異性引物對(duì)包含三條ABCG2基因的正向引物SEQID Nos：1、SEQ ID Nos：3、SEQ ID Nos：5，和三條ABCG2基因的反向引物SEQ ID Nos：2、SEQID Nos：4、SEQ ID Nos：6，以及一條SLC2A9基因的正向引物SEQ ID Nos：7，和一條SLC2A9基因的反向引物SEQ ID Nos：8。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的人類痛風(fēng)相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括ABCG2和SLC2A9基因的單堿基延伸引物，所述ABCG2基因的單堿基延伸引物包含四條單堿基延伸引物SEQ ID Nos：9，SEQ ID Nos：10，SEQ ID Nos：11，SEQ ID Nos：12，所述SLC2A9基因的單堿基延伸引物包含一條單堿基延伸引物SEQ ID Nos：13。