[發明專利]一種反式茴香腦加氧酶突變體的高通量篩選方法及突變菌株和突變體

有效

• 申請號: 201810663244.6
• 申請日: 2018-06-25
• 公開（公告）號: CN108753912B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 鄭璞;劉思琴;王玉琴;陳鵬程;聞鵬
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C40B50/06;C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 南京禹為知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 王曉東

本發明公開了一種反式茴香腦加氧酶突變體的高通量篩選方法及突變菌株和突變體，包括以反式茴香腦加氧酶基因為模板，進行易錯PCR，獲得反式茴香腦加氧酶突變體文庫；將所述反式茴香腦加氧酶反應底物添加入含有反式茴香腦加氧酶突變體的溶液中進行催化反應，將反應液與2,4?二硝基苯肼進行顯色反應，并加入堿溶液及有機溶劑反應，測定吸光度。本發明通過易錯PCR構建突變庫，并建立以2,4?二硝基苯肼為顯色劑，酶標儀測定OD₄₇₀為基礎的高通量篩選方式，篩選合成洋茉莉醛重組菌株的突變菌株，該方式具有高效、精準、快速的優勢，突變株LSQ?3對于合成洋茉莉醛、對茴香醛以及香蘭素的催化效率均顯著提高，具有良好的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種反式茴香腦加氧酶突變體的高通量篩選方法及突變菌株和突變體。

背景技術

丙烯基苯型精油單分是通過物理的方法從植物精油中提取的某一種丙烯基苯化合物，這類化合物的共同特征是具有丙烯基側鏈，并且在苯環上具有甲氧基取代基團，常被作為合成帶有苯環結構的名貴香料和藥物的起始物(如香草醛、洋茉莉醛、茴香醛等)。由于化學合成香料在香料生產上存有：香料化合物中殘留的化學物質給人體健康帶來危害、化學合成會帶來環境的污染、化學合成反應立體選擇性差而導致產物為外消旋體等的缺陷。目前，生物合成香料化合物的技術越來越受到人們的關注。

反式茴香腦加氧酶(TAO)，由Han等人最先在惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaJYR-1中發現，該酶能氧化反式茴香腦合成對茴香醛，同時也能氧化異丁香酚、異黃樟素和對甲氧基異丁香酚，但催化效率不高，E.coli BL21(DE3)(pET-TAO)在含0.5mmol·L^-1的葡萄糖和1mmol·L^-1的不同底物溶液中,反應6h，能分別合成0.63mmol·L^-1對茴香醛和香草醛、0.38mmol·L^-1的洋茉莉醛和藜蘆醛。

發明內容

本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。

鑒于上述的技術缺陷，提出了本發明。

因此，作為本發明其中一個方面，本發明克服現有技術中存在的不足，提供一種反式茴香腦加氧酶突變體的高通量篩選方法。

為解決上述技術問題，本發明提供了如下技術方案：一種反式茴香腦加氧酶突變體的高通量篩選方法，其包括，

以反式茴香腦加氧酶基因為模板，進行易錯PCR，獲得反式茴香腦加氧酶突變體文庫；

將所述反式茴香腦加氧酶反應底物添加入含有反式茴香腦加氧酶突變體的溶液中進行催化反應，將反應液與2,4-二硝基苯肼進行顯色反應，并加入堿溶液及有機溶劑反應，測定吸光度。

作為本發明所述的反式茴香腦加氧酶突變體的高通量篩選方法的一種優選方案：

所述易錯PCR，包括設計易錯PCR引物，所述易錯PCR引物為：

taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGCtaoD：

GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG