[發明專利]一種反式茴香腦加氧酶突變體及其突變株

有效

• 申請號: 201810662130.X
• 申請日: 2018-06-25
• 公開（公告）號: CN108753742B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 王玉琴;鄭璞;劉思琴;陳鵬程;聞鵬
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京禹為知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 王曉東

本發明公開了一種反式茴香腦加氧酶突變體及其突變株，其中，所述反式茴香腦加氧酶突變體與野生型反式茴香腦加氧酶氨基酸序列相比，319位氨基酸脯氨酸變為絲氨酸，所述反式茴香腦加氧酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發明通過易錯PCR的方式，隨機突變了反式茴香腦加氧酶，并導入到E.Coli BL21(DE3)中，經過篩選后獲得突變重組菌4C7，其合成對茴香醛、藜蘆醛的轉化速率分別為原始野生型菌株的2.05、2.38倍，更適合用工業生產應用，能夠降低成本，顯著提高生產效率。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種反式茴香腦加氧酶突變體及其突變株。

背景技術

丙烯基苯型精油單分是通過物理的方法從植物精油中提取的某一種丙烯基苯化合物，這類化合物的共同特征是具有丙烯基側鏈，并且在苯環上具有甲氧基取代基團，常被作為合成帶有苯環結構的名貴香料和藥物的起始物(如香草醛、洋茉莉醛、茴香醛等)。由于化學合成香料在香料生產上存有：香料化合物中殘留的化學物質給人體健康帶來危害、化學合成會帶來環境的污染、化學合成反應立體選擇性差而導致產物為外消旋體等的缺陷。目前，生物合成香料化合物的技術越來越受到人們的關注。

反式茴香腦加氧酶(TAO)，由Han等人最先在惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaJYR-1中發現，該酶能氧化反式茴香腦合成對茴香醛，同時也能氧化異丁香酚、異黃樟素和對甲氧基異丁香酚，但催化效率不高，E.coli BL21(DE3)(pET-TAO)在含0.5mmol·L^-1的葡萄糖和1mmol·L^-1的不同底物溶液中,反應6h，能分別合成0.63mmol·L-1對茴香醛和香草醛、0.38mmol·L^-1的洋茉莉醛和藜蘆醛。

發明內容

本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。

因此，作為本發明其中一個方面，本發明克服現有技術中存在的不足，提供一種反式茴香腦加氧酶突變體。

為解決上述技術問題，本發明提供了如下技術方案：一種反式茴香腦加氧酶突變體，其中：所述反式茴香腦加氧酶突變體與野生型反式茴香腦加氧酶氨基酸序列相比，其319位氨基酸脯氨酸變為絲氨酸，所述反式茴香腦加氧酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。

作為本發明所述的反式茴香腦加氧酶突變體的一種優選方案：所述反式茴香腦加氧酶突變體，其是通過以反式茴香腦加氧酶基因為模板，進行易錯PCR，獲得反式茴香腦加氧酶突變體文庫，并將所述反式茴香腦加氧酶的反應底物添加入含有反式茴香腦加氧酶突變體的溶液中進行催化反應，將反應液與2,4-二硝基苯肼進行顯色反應，并加入堿溶液及有機溶劑反應，測定吸光度后篩選得到。

作為本發明所述的反式茴香腦加氧酶突變體的一種優選方案：所述易錯PCR，包括設計易錯PCR引物，所述易錯PCR引物為：

taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGC

taoD：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。

作為本發明所述的反式茴香腦加氧酶突變體的一種優選方案：所述獲得反式茴香腦加氧酶突變體文庫，包括以重組質粒PGEX-6P-1-tao為模板，rTaq聚合酶進行易錯PCR獲得隨機突變，PCR體系中添加濃度為7～10mmol·L-¹的Mg²⁺以及30～250μmol·L-¹的Mn²⁺，PCR產物連接至線性質粒PGEX-6P-1，再將連接產物導入感受態細胞E.coliBL21(DE3)中，獲得反式茴香腦加氧酶突變體文庫。