[發明專利]一種馬鈴薯StDWF1基因及其制備方法以及過表達該基因以促進馬鈴薯快速生根的方法

在審

• 申請號: 201810661601.5
• 申請日: 2018-06-25
• 公開（公告）號: CN108728454A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 王西瑤;鄧孟勝;唐曉;鄒雪;張杰;李立芹;蔡誠誠;彭潔;余麗萍;王宇;祝淵智
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 成都弘毅天承知識產權代理有限公司 51230
• 代理人: 蔣秀清;李春芳

1.一種馬鈴薯StDWF1基因，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一種馬鈴薯StDWF1基因的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)從馬鈴薯品種費烏瑞它試管苗中提取總RNA；

(2)根據提取的總RNA反轉錄合成cDNA；

(3)PCR擴增，以cDNA為模板，在cDNA的CDS區前引入XbaI和SmaI酶切位點，設計擴增引物StDWF1PF和StDWF1PR，并添加引物StDWF1PF、引物StDWF1PR、10×擴增緩沖液、無菌水、dNTPs、Taq DNA聚合酶混勻并進行PCR擴增，其中，cDNA、引物StDWF1PF、引物StDWF1PR、10×擴增緩沖液、無菌水、dNTPs、Taq DNA聚合酶的容積分別為：1μL、1μL、1μL、2μL、15.3μL、0.5μL、0.2μL，并且cDNA、引物StDWF1PF、引物StDWF1PR以及dNTPs的濃度分別為10～100ng/L、2μM/μl、2μM/μl、10mmol/L；

擴增引物StDWF1PF、StDWF1PR的堿基序列分別如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；

(4)回收純化PCR擴增產物，經測序分析得到馬鈴薯StDWF1基因。

3.如權利要求2所述的一種馬鈴薯StDWF1基因的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，提取費烏瑞它試管苗總RNA的時機是葉片出苗期，提取部位是費烏瑞它試管苗的嫩葉。

4.如權利要求2所述的一種馬鈴薯StDWF1基因的制備方法，其特征在于，步驟(1)中總RNA的提取方法采用Trizol法，具體步驟如下：

(1a)研磨：研缽放入4勺液氮和馬鈴薯品種費烏瑞它樣品部位，液氮揮發完后迅速磨成細粉，迅速裝入EP管后加1mL Trizol，劇烈混勻，室溫放5-10min；

(1b)4℃12000rpm離心5min，吸取上清至新管中，并加入200ml氯仿，輕微上下搖晃，室溫靜置5min；

(1c)4℃12000rpm離心10min，吸取上清液到新管，加入等體積酚/氯仿/異戊醇，顛倒混勻；

(1d)4℃12000rpm離心20min，吸取上清液到新管，逐漸加入無水乙醇使其終濃度為12％，上下顛倒混勻后迅速離心；

(1e)4℃12000rpm離心10min，吸取400mL上清液到新管，加入0.7倍體積異丙醇上下顛倒混勻，并加入0.2倍體積1mol/L NaAc-20℃沉淀1h；

(1f)4℃12000rpm離心15min，棄上清，加入1mL 75％乙醇洗沉淀，4℃、8500rpm離心3min，再加1mL 75％乙醇洗2遍；

(1g)倒掉上清，盡量吸掉多余液體，超凈臺上吹風10min除殘留乙醇，加入80mLDEPC處理水，立即放入55℃水浴5min，-80℃60min，重復2次；

(1h)4℃12000rpm離心20min，小心吸取上清70μL，注意不接觸底部，即得到總RNA，于-80℃凍存備用；

其中，步驟(1c)-(1h)均在冰上操作。

5.如權利要求2所述的一種馬鈴薯StDWF1基因的制備方法，其特征在于，步驟(2)中總RNA反轉錄合成cDNA，按TakaRa公司的cDNA合成試劑盒使用說明進行反轉錄，總反應體系體積為20μl，使用RNase free離心管，反應體系如下：

65℃變性5分鐘，迅速在冰上冷卻至少1分鐘，稍微離心，然后加入：

混合均勻，55℃反應60min，70℃15min使酶失活，-20℃保存。