[發明專利]一種運用熒光聚合酶鏈式反應技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法

在審

• 申請號: 201810656027.4
• 申請日: 2018-06-23
• 公開（公告）號: CN108977560A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 劉瀅佳;謝宇希;邵楚瑤
• 申請（專利權）人: 劉瀅佳
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種運用熒光聚合酶鏈式反應技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法，屬于過敏原檢測技術，特別是指外切酶探針熒光聚合酶鏈式反應技術(TaqMan)檢測食品中過敏原榛果成分的方法。其技術方案是針對過敏原榛果成分序列設計引物及TaqMan探針，建立熒光聚合酶鏈式反應檢測方法。本發明包括設計的榛果成分特異性的引物和探針以及與之配套的熒光聚合酶鏈式反應反應條件。本方法，與花生、麥粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃等沒有交叉反應，具有很好的特異性，檢測靈敏度可達到5mg/kg。本發明所載明的方法可以用于檢測食品中的過敏原，避免使用該類食物導致的過敏反應，具有實際意義。

技術領域

本發明涉及屬于過敏原檢測技術，具體地說是運用熒光聚合酶鏈式反應反應來檢測過 敏原的技術，特別是食品中過敏原榛果成分的方法。

背景技術

食物過敏是人們對食物產生的一種不良反應，屬于機體對外源性物質的一種變態反 應。近二十年來，食物過敏逐漸被重視，已被認為是嚴重的公共衛生問題，而且WHO 預測食物過敏可能成為今后最常見的流行病之一。根據美國FDA資料統計，在美國，2 ％的成年人和5％的嬰幼兒患有食物過敏癥，每年大約30000人需要臨床緊急治療，150 人死于食物引起的過敏反應。在所有過敏反應中，花生和樹堅果過敏占10-47％。

FDA于2005年10月5日發布《食品過敏原標識和消費者保護法案-2004》(FALCPA)，規定主要食物過敏原包括樹堅果等八種食物的成分。日本標簽標注也要求將樹堅果列為推薦標注成分。據國外有關學者應用ELISA方法結合聚合酶鏈式反應-ELISA法對商品進 行調查，在41種市售商品中就有27種含有過敏原榛果成分而未在標簽中標識。

目前國內外對過敏原榛果成分的檢測研究主要集中在ELISA、聚合酶鏈式反應 -ELISA、聚合酶鏈式反應、熒光聚合酶鏈式反應及生物傳感器檢測等方面。目前對于過 敏原的檢測方法FDA和AOAC共同研究推薦使用的試劑盒有三種，均為ELISA方法。 但如果產品中蛋白質遭到破壞，ELISA方法就檢測不到。而DNA比蛋白質穩定，聚合 酶鏈式反應方法較ELISA方法更為準確，并且避免了對大量抗體的需求，歐盟、日本和 AOAC都建議使用聚合酶鏈式反應方法進行確證，但沒有明確特異性的引物序列。本研 究針對榛果成分rCor a1.0401DNA序列設計引物及TaqMan探針，建立了運用熒光聚合 酶鏈式反應技術檢測食品中過敏原榛果成分的方法。

發明內容

針對上述情況，本發明克服了現有技術中的缺點，提供了運用熒光聚合酶鏈式反應技 術檢測食品中過敏原榛果成分的方法，具體的講就是，外切酶探針熒光聚合酶鏈式反應 技術(Taqman探針法)檢測食品中過敏原榛果成分的方法。

其技術內容包括：使用該方法所使用的引物、探針及構建的報告質粒。其中引物、探 針的全部序列如下：

引物：

所用引物序列一：CCCCGCTGTATGTGATAT

所用引物序列二：ATGATAATACGCGATACTGTGAT

探針：

所用探針序列：TCCCGTTCTCGTCCCTGCCGT

以及由上述序列衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反 義互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。還包括與之配套的熒光聚合酶鏈式反 應反應條件。

本發明是通過以下技術方案實現的：

(1)設計特異性寡核苷酸引物、探針，將探針法探針序列三用FAM熒光基團標記，用于外切酶探針熒光聚合酶鏈式反應技術檢測；

(2)以探針法引物序列一和探針法引物序列二作為引物，以食品中過敏原榛果成分的 相關基因DNA為模板，進行目的基因的特異性擴增；